Quyết định 3287/QĐ-BYT năm 2025 về Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử” do Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành

QUYẾT ĐỊNH

VỀ VIỆC BAN HÀNH TÀI LIỆU CHUYÊN MÔN “HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT VỀ DI TRUYỀN - SINH HỌC PHÂN TỬ”

BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ

Căn cứ Luật Khám bệnh, chữa bệnh năm 2023;

Căn cứ Nghị định số 42/2025/NĐ-CP ngày 27 tháng 02 năm 2025 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Y tế;

Căn cứ Thông tư số 23/2024/TT-BYT ngày 18 tháng 10 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành Danh mục kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh; Căn cứ Quyết định số 622/QĐ-BYT ngày 14 tháng 03 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc thành lập Hội đồng chuyên môn nghiệm thu “Hướng dẫn quy trình chuyên môn kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử”;

Căn cứ Biên bản họp ngày 08 tháng 08 năm 2025 của Hội đồng chuyên môn nghiệm thu “Hướng dẫn quy trình chuyên môn kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử”; Công văn số 1130/HHTM ngày 20 tháng 08 năm 2025 của Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương về việc hoàn thiện Hướng dẫn Quy trình chuyên môn kỹ thuật khám bệnh, chữa bệnh;

Theo đề nghị của Cục trưởng Cục Quản lý Khám, chữa bệnh.

QUYẾT ĐỊNH:

Điều 1. Ban hành kèm theo Quyết định này Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử” - Tập 2, gồm 52 quy trình kỹ thuật (Tài liệu chuyên môn kèm theo).

Điều 2. Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử” được áp dụng tại các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh.

Điều 3. Quyết định này có hiệu lực kể từ ngày 01/7/2026.

Điều 4. Các ông, bà: Chánh Văn phòng Bộ; Cục trưởng Cục Quản lý Khám, chữa bệnh; Cục trưởng, Vụ trưởng các Cục, Vụ thuộc Bộ Y tế; Giám đốc các bệnh viện trực thuộc Bộ Y tế; Giám đốc Sở Y tế các tỉnh, thành phố trực thuộc trung ương; Thủ trưởng Y tế các ngành và các cơ quan, đơn vị liên quan chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này./.

HƯỚNG DẪN

QUY TRÌNH CHUYÊN MÔN KỸ THUẬT
VỀ DI TRUYỀN - SINH HỌC PHÂN TỬ

(TẬP 2)

(Ban hành kèm theo Quyết định số 3287/QĐ-BYT ngày 17 tháng 10 năm 2025 của Bộ trưởng Bộ Y tế)

LỜI NÓI ĐẦU

Bộ Y tế đã xây dựng và ban hành Tài liệu “Hướng dẫn Quy trình kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử” năm 2014, 2016. Hướng dẫn Quy trình kỹ thuật này là căn cứ để cơ sở khám bệnh, chữa bệnh, người hành nghề khám bệnh, chữa bệnh, nhân viên y tế triển khai áp dụng và thực hiện kỹ thuật khám, chữa bệnh.

Trong những năm gần đây, với sự phát triển về khoa học kỹ thuật trên thế giới và năng lực người thực hiện kỹ thuật, nhằm cập nhật, bổ sung những tiến bộ mới và tiếp tục chuẩn hóa quy trình thực hiện kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh, Bộ Y tế đã giao một số bệnh viện làm đầu mối xây dựng, cập nhật Hướng dẫn Quy trình chuyên môn kỹ thuật Di truyền - Sinh học phân tử như Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, Bệnh viện K, Bệnh viện Nhi Trung ương, Bệnh viện Phụ sản Trung ương, Bệnh viện Bạch Mai, các bệnh viện được giao đã huy động và phân công các giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ, bác sĩ chuyên khoa… biên soạn Hướng dẫn quy trình kỹ thuật; tổ chức họp hội đồng khoa học trong bệnh viện để nghiệm thu; biên tập, hoàn thiện theo ý kiến của Hội đồng chuyên môn nghiệm thu do Bộ Y tế thành lập và chịu trách nhiệm về chuyên môn kỹ thuật quy định trong Hướng dẫn quy trình kỹ thuật. Hướng dẫn quy trình kỹ thuật đều được các thành viên biên soạn rà soát với hướng dẫn hiện hành, tham khảo các tài liệu trong nước, nước ngoài để cập nhật phù hợp với thực tế hiện nay.

Bộ Y tế đã thành lập Hội đồng chuyên môn nghiệm thu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật với sự tham gia của một số Vụ, Cục chức năng của Bộ Y tế, các chuyên gia về Di truyền - Sinh học phân tử trong cả nước. Các thành viên Hội đồng đã làm việc với tinh thần trách nhiệm, đóng góp về thời gian, trí tuệ, kinh nghiệm để góp ý, nghiệm thu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật.

Để hoàn thành Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn Quy trình kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử”, Cục Quản lý Khám chữa bệnh - Bộ Y tế xin trân trọng cảm ơn sự đóng góp công sức, trí tuệ, kinh nghiệm của các giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ, bác sĩ chuyên khoa, chuyên ngành hàng đầu trong lĩnh vực Di truyền Y học và Sinh học phân tử đã tham gia với vai trò là thành viên Ban biên soạn, thành viên Hội đồng góp ý và nghiệm thu Tài liệu chuyên môn.

Trong quá trình biên soạn, biên tập, in ấn tài liệu, mặc dù Ban Biên soạn đã hết sức cố gắng nhưng khó tránh khỏi hoàn toàn những thiếu sót, chúng tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến từ quý độc giả đồng nghiệp để Tài liệu chuyên môn ngày một hoàn thiện hơn. Mọi ý kiến góp ý xin gửi về Cục Quản lý Khám, chữa bệnh - Bộ Y tế, 138A, Giảng Võ, Hà Nội.

QUYẾT ĐỊNH

VỀ VIỆC BAN HÀNH TÀI LIỆU CHUYÊN MÔN “HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT VỀ DI TRUYỀN - SINH HỌC PHÂN TỬ”

BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ

Căn cứ Luật Khám bệnh, chữa bệnh năm 2023;

Căn cứ Nghị định số 42/2025/NĐ-CP ngày 27 tháng 02 năm 2025 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Y tế;

Căn cứ Thông tư số 23/2024/TT-BYT ngày 18 tháng 10 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành Danh mục kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh; Căn cứ Quyết định số 622/QĐ-BYT ngày 14 tháng 03 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc thành lập Hội đồng chuyên môn nghiệm thu “Hướng dẫn quy trình chuyên môn kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử”;

Căn cứ Biên bản họp ngày 08 tháng 08 năm 2025 của Hội đồng chuyên môn nghiệm thu “Hướng dẫn quy trình chuyên môn kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử”; Công văn số 1130/HHTM ngày 20 tháng 08 năm 2025 của Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương về việc hoàn thiện Hướng dẫn Quy trình chuyên môn kỹ thuật khám bệnh, chữa bệnh;

Theo đề nghị của Cục trưởng Cục Quản lý Khám, chữa bệnh.

QUYẾT ĐỊNH:

Điều 1. Ban hành kèm theo Quyết định này Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử” - Tập 2, gồm 52 quy trình kỹ thuật (Tài liệu chuyên môn kèm theo).

Điều 2. Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử” được áp dụng tại các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh.

Điều 3. Quyết định này có hiệu lực kể từ ngày 01/7/2026.

Điều 4. Các ông, bà: Chánh Văn phòng Bộ; Cục trưởng Cục Quản lý Khám, chữa bệnh; Cục trưởng, Vụ trưởng các Cục, Vụ thuộc Bộ Y tế; Giám đốc các bệnh viện trực thuộc Bộ Y tế; Giám đốc Sở Y tế các tỉnh, thành phố trực thuộc trung ương; Thủ trưởng Y tế các ngành và các cơ quan, đơn vị liên quan chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này./.

HƯỚNG DẪN

QUY TRÌNH CHUYÊN MÔN KỸ THUẬT
VỀ DI TRUYỀN - SINH HỌC PHÂN TỬ

(TẬP 2)

(Ban hành kèm theo Quyết định số 3287/QĐ-BYT ngày 17 tháng 10 năm 2025 của Bộ trưởng Bộ Y tế)

LỜI NÓI ĐẦU

Bộ Y tế đã xây dựng và ban hành Tài liệu “Hướng dẫn Quy trình kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử” năm 2014, 2016. Hướng dẫn Quy trình kỹ thuật này là căn cứ để cơ sở khám bệnh, chữa bệnh, người hành nghề khám bệnh, chữa bệnh, nhân viên y tế triển khai áp dụng và thực hiện kỹ thuật khám, chữa bệnh.

Trong những năm gần đây, với sự phát triển về khoa học kỹ thuật trên thế giới và năng lực người thực hiện kỹ thuật, nhằm cập nhật, bổ sung những tiến bộ mới và tiếp tục chuẩn hóa quy trình thực hiện kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh, Bộ Y tế đã giao một số bệnh viện làm đầu mối xây dựng, cập nhật Hướng dẫn Quy trình chuyên môn kỹ thuật Di truyền - Sinh học phân tử như Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, Bệnh viện K, Bệnh viện Nhi Trung ương, Bệnh viện Phụ sản Trung ương, Bệnh viện Bạch Mai, các bệnh viện được giao đã huy động và phân công các giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ, bác sĩ chuyên khoa… biên soạn Hướng dẫn quy trình kỹ thuật; tổ chức họp hội đồng khoa học trong bệnh viện để nghiệm thu; biên tập, hoàn thiện theo ý kiến của Hội đồng chuyên môn nghiệm thu do Bộ Y tế thành lập và chịu trách nhiệm về chuyên môn kỹ thuật quy định trong Hướng dẫn quy trình kỹ thuật. Hướng dẫn quy trình kỹ thuật đều được các thành viên biên soạn rà soát với hướng dẫn hiện hành, tham khảo các tài liệu trong nước, nước ngoài để cập nhật phù hợp với thực tế hiện nay.

Bộ Y tế đã thành lập Hội đồng chuyên môn nghiệm thu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật với sự tham gia của một số Vụ, Cục chức năng của Bộ Y tế, các chuyên gia về Di truyền - Sinh học phân tử trong cả nước. Các thành viên Hội đồng đã làm việc với tinh thần trách nhiệm, đóng góp về thời gian, trí tuệ, kinh nghiệm để góp ý, nghiệm thu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật.

Để hoàn thành Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn Quy trình kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử”, Cục Quản lý Khám chữa bệnh - Bộ Y tế xin trân trọng cảm ơn sự đóng góp công sức, trí tuệ, kinh nghiệm của các giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ, bác sĩ chuyên khoa, chuyên ngành hàng đầu trong lĩnh vực Di truyền Y học và Sinh học phân tử đã tham gia với vai trò là thành viên Ban biên soạn, thành viên Hội đồng góp ý và nghiệm thu Tài liệu chuyên môn.

Trong quá trình biên soạn, biên tập, in ấn tài liệu, mặc dù Ban Biên soạn đã hết sức cố gắng nhưng khó tránh khỏi hoàn toàn những thiếu sót, chúng tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến từ quý độc giả đồng nghiệp để Tài liệu chuyên môn ngày một hoàn thiện hơn. Mọi ý kiến góp ý xin gửi về Cục Quản lý Khám, chữa bệnh - Bộ Y tế, 138A, Giảng Võ, Hà Nội.

Trân trọng cảm ơn!

NGUYÊN TẮC XÂY DỰNG, BAN HÀNH VÀ ÁP DỤNG HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT TRONG KHÁM BỆNH, CHỮA BỆNH

1. Nguyên tắc xây dựng và ban hành Hướng dẫn quy trình kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh:

a) Hướng dẫn quy trình kỹ thuật được xây dựng và ban hành theo từng chương, chuyên ngành bảo đảm đầy đủ các nội dung cơ bản về chỉ định, chống chỉ định, thận trọng, chuẩn bị đến các các bước thực hiện kỹ thuật theo trình tự thực hiện từ khi bắt đầu đến khi kết thúc thực hiện kỹ thuật;

b) Thời gian thực hiện kỹ thuật, nhân lực, thuốc, thiết bị y tế… (danh mục và số lượng) được quy định trong Hướng dẫn quy trình kỹ thuật căn cứ trên yêu cầu chuyên môn, tính phổ biến, thường quy thực hiện tại cơ sở khám bệnh, chữa bệnh. Trong thực tế triển khai, thời gian thực hiện kỹ thuật, nhân lực, thuốc, thiết bị y tế… (danh mục và số lượng) có thể thay đổi dựa trên cá thể người bệnh, tình trạng bệnh, diễn biến lâm sàng… và điều kiện thực tế hạ tầng, thiết bị, nhân lực của mỗi cơ sở khám bệnh, chữa bệnh;

c) Ngoài địa điểm thực hiện kỹ thuật như phòng phẫu thuật (phòng mổ), phòng thực hiện kỹ thuật (phòng thủ thuật), phòng bệnh... được quy định trong Hướng dẫn quy trình kỹ thuật, kỹ thuật có thể được thực hiện ở các địa điểm khác theo nguyên tắc:

- Kỹ thuật được quy định thực hiện ở phòng bệnh thì kỹ thuật đó được phép thực hiện tại phòng thực hiện kỹ thuật, phòng phẫu thuật;

- Kỹ thuật được quy định thực hiện ở phòng thực hiện kỹ thuật thì kỹ thuật đó được phép thực hiện tại phòng phẫu thuật;

- Các kỹ thuật chỉ được phép thực hiện tại các địa điểm khác trong trường hợp cấp cứu theo quy định pháp luật về khám bệnh, chữa bệnh.

2. Nguyên tắc áp dụng Hướng dẫn quy trình kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh:

a) Cơ sở khám bệnh, chữa bệnh được phép áp dụng toàn bộ Hướng dẫn quy trình kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh do Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành và phải có văn bản do người đứng đầu cơ sở khám bệnh, chữa bệnh phê duyệt việc triển khai áp dụng toàn bộ Hướng dẫn quy trình kỹ thuật do Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành.

b) Trường hợp cơ sở khám bệnh, chữa bệnh xây dựng và ban hành Hướng dẫn quy trình kỹ thuật áp dụng tại cơ sở khám bệnh, chữa bệnh thì tuân thủ theo nguyên tắc xây dựng. Căn cứ Hướng dẫn quy trình kỹ thuật tương ứng do Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành, Thủ trưởng cơ sở khám bệnh, chữa bệnh chỉ đạo xây dựng, ban hành, triển khai, áp dụng phù hợp với đơn vị và hoàn toàn trách nhiệm về việc xây dựng, ban hành, triển khai và áp dụng.

c) Tài liệu chuyên môn Hướng dẫn quy trình kỹ thuật ban hành kèm theo Quyết định này được áp dụng cho các kỹ thuật quy định tại Phụ lục số 02 và không có trong Phụ lục số 01, Thông tư số 23/2024/TT-BYT ngày 18 tháng 10 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành danh mục kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh.

d) Người thực hiện các kỹ thuật khám bệnh, chữa bệnh là người hành nghề có phạm vi hành nghề phù hợp với kỹ thuật khám bệnh, chữa bệnh, theo quy định của Luật Khám bệnh, chữa bệnh, không bị giới hạn bởi các chức danh nghề nghiệp được liệt kê trong từng quy trình kỹ thuật.

đ) Cơ sở khám bệnh, chữa bệnh chỉ được thực hiện kỹ thuật khám bệnh, chữa bệnh sau khi được cấp có thẩm quyền phê duyệt, cho phép và sử dụng thuốc, thiết bị y tế được cấp phép theo quy định hiện hành.

e) Trong quá trình triển khai áp dụng Hướng dẫn quy trình kỹ thuật, nếu có các bất cập hoặc nhu cầu cần sửa đổi, bổ sung, cập nhật…, các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh chủ động cập nhật và ban hành Hướng dẫn quy trình kỹ thuật áp dụng tại cơ sở khám bệnh, chữa bệnh, đồng thời báo cáo, đề xuất Bộ Y tế (Cục Quản lý Khám, chữa bệnh) để xem xét ban hành áp dụng trong cả nước.

MỤC LỤC

1. XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC TRƯỚC SINH CÁC BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ BẰNG KỸ THUẬT NGS

2. XÉT NGHIỆM GEN TRƯỚC SINH KHÔNG XÂM LẤN BẰNG KỸ THUẬT NGS

3. XÉT NGHIỆM TẠP NHIỄM MÁU MẸ TRONG DỊCH ỐI BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ĐOẠN DNA TRÊN ĐIỆN DI MAO QUẢN

4. XÉT NGHIỆM BIẾN THỂ GEN BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ĐOẠN DNA TRÊN ĐIỆN DI MAO QUẢN

5. XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI/TRƯỚC LÀM TỔ (PGT) BẰNG KỸ THUẬT NGS

6. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ TRƯỚC CHUYỂN PHÔI/ TRƯỚC LÀM TỔ (PGT-A) BẰNG KỸ THUẬT BOBS

7. KHÁM VÀ TƯ VẤN BỆNH DI TRUYỀN

8. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ BẰNG KỸ THUẬT DNA MICROARRAY

9. XÉT NGHIỆM CÁC GEN BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX REAL-TIME PCR

10. XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI/ TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH ĐƠN GEN (PGT-M) BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN SANGER

11. XÉT NGHIỆM GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI DNA

12. XÉT NGHIỆM GEN VỚI cfDNA BẰNG KỸ THUẬT DIGITAL-PCR

13. XÉT NGHIỆM GEN VỚI cfDNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR

14. XÉT NGHIỆM GEN VỚI cfDNA BẰNG KỸ THUẬT NGS

15. XÉT NGHIỆM CÁC BIẾN THỂ GEN GÂY BỆNH ALPHA VÀ BETA THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT LAI DNA

16. XÉT NGHIỆM TỶ LỆ CÒN BỆNH TỒN DƯ TỐI THIỂU (MRD) VỚI MÁU TOÀN PHẦN BẰNG KỸ THUẬT RQ-PCR

17. XÉT NGHIỆM TỶ LỆ CÒN BỆNH TỐI THIỂU (MRD) THEO DÒNG TẾ BÀO BẰNG KỸ THUẬT RQ-PCR HOẶC DIGITAL-PCR

18. XÉT NGHIỆM BIỂU HIỆN GEN BẰNG KỸ THUẬT MICROARRAY (GEP)

19. XÉT NGHIỆM TỶ LỆ MỌC MẢNH GHÉP (CHIMERISM) VỚI MÁU TOÀN PHẦN BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ĐOẠN DNA TRÊN ĐIỆN DI MAO QUẢN

20. XÉT NGHIỆM TỶ LỆ MỌC MẢNH GHÉP (CHIMERISM) THEO DÒNG TẾ BÀO BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ĐOẠN DNA TRÊN ĐIỆN DI MAO QUẢN

21. XÉT NGHIỆM CHỈ THỊ STR CẶP GHÉP BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ĐOẠN TRÊN ĐIỆN DI MAO QUẢN

22. XÉT NGHIỆM GEN TRƯỚC SINH KHÔNG XÂM LẤN BẰNG KỸ THUẬT DIGITAL-PCR HOẶC REAL-TIME PCR

23. XÉT NGHIỆM GEN VỚI ctDNA BẰNG KỸ THUẬT DIGITAL-PCR

24. XÉT NGHIỆM GEN VỚI ctDNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR

25. XÉT NGHIỆM ĐỘ MẤT ỔN ĐỊNH VI VỆ TINH (MSI) BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

26. XÉT NGHIỆM QUAN HỆ HUYẾT THỐNG BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ĐOẠN DNA TRÊN ĐIỆN DI MAO QUẢN

27. XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI (Pre-PGT-M) (XÉT NGHIỆM TIỀN LÂM SÀNG DI TRUYỀN TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH ĐƠN GEN (PRE-PGT-M))

28. XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI/ TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH ĐƠN GEN (PGT-M) BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH DI TRUYỀN LIÊN KẾT

29. XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI/ TRƯỚC LÀM TỔ LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ (PGT-A) BẰNG KỸ THUẬT NGS

30. XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI/ TRƯỚC LÀM TỔ BẤT THƯỜNG CẤU TRÚC NHIỄM SẮC THỂ (PGT-SR) BẰNG KỸ THUẬT NGS

31. XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI/ TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH ĐƠN GEN (PGT-M) BẰNG KỸ THUẬT NGS

32. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ PHÂN TỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI TẠI CHỖ GẮN ĐA MÀU MULTI-FISH

33. XÉT NGHIỆM BIẾN THỂ GEN BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

34. XÉT NGHIỆM CÁC BIẾN THỂ GEN BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX RT-PCR

35. XÉT NGHIỆM CÁC BIẾN THỂ GEN BẰNG KỸ THUẬT LR-PCR

36. XÉT NGHIỆM XÁC ĐỊNH METHYL HÓA BẰNG KỸ THUẬT PCR

37. XÉT NGHIỆM XÁC ĐỊNH METHYL HÓA BẰNG KỸ THUẬT REAL- TIME PCR

38. XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT DIGITAL-PCR

39. XÉT NGHIỆM CÁC BIẾN THỂ GEN BẰNG KỸ THUẬT DIGITAL- PCR

40. XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT MS-MLPA

41. XÉT NGHIỆM CÁC GEN BẰNG KỸ THUẬT MS-MLPA

42. XÉT NGHIỆM GIẢI TRÌNH TỰ HỆ GEN MÃ HÓA (WES) BẰNG KỸ  THUẬT NGS

43. XÉT NGHIỆM GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ HỆ GEN (WGS) BẰNG KỸ THUẬT NGS

44. XÉT NGHIỆM GIẢI TRÌNH TỰ GEN BẰNG KỸ THUẬT PYROSEQUENCING

45. XÉT NGHIỆM SUY GIẢM CHỨC NĂNG TÁI TỔ HỢP TƯƠNG ĐỒNG (HRD) BẰNG KỸ THUẬT NGS

46. XÁC ĐỊNH TỶ LỆ CÒN BỆNH TỐI THIỂU (MRD) MÁU TOÀN PHẦN BẰNG KỸ THUẬT NGS

47. XÁC ĐỊNH TỶ LỆ CÒN BỆNH TỐI THIỂU (MRD) THEO DÒNG TẾ

BÀO BẰNG KỸ THUẬT NGS

48. XÁC ĐỊNH TỶ LỆ CÒN BỆNH TỐI THIỂU (MRD) BẰNG KỸ THUẬT NGS

49. XÉT NGHIỆM MARKER DI TRUYỀN CẶP GHÉP BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR

50. XÉT NGHIỆM GIẢI TRÌNH TỰ HỆ GEN BỆNH LÝ (CES) BẰNG KỸ THUẬT NGS

51. NUÔI CẤY TẾ BÀO DỊCH ỐI

52. NUÔI CẤY TẾ BÀO GAI RAU

PHỤ LỤC

DANH MỤC KỸ THUẬT

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

1. XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC TRƯỚC SINH CÁC BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ BẰNG KỸ THUẬT NGS

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mục đích của kỹ thuật nhằm sàng lọc các bất thường nhiễm sắc thể hay gặp ở thai nhi, các bất thường đó là trisomy 21 gây hội chứng: Down, trisomy 18 gây hội chứng Edwards, trisomy 13 gây hội chứng Patau, hội chứng Turner, hội chứng Klinefelter… Một số mất đoạn nhỏ như hội chứng Digeorge…

1.2. Định nghĩa

Xét nghiệm sàng lọc trước sinh các bất thường nhiễm sắc thể bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới - NGS (NGS - Next Generation Sequencing) còn được gọi là Xét nghiệm trước sinh không xâm lấn (NIPT - Noninvasive prenatal test). Xét nghiệm này dựa trên việc phân tích DNA tự do của thai trong máu ngoại vi của mẹ. DNA tự do của bào thai (cffDNA - cell free fetal DNA) có nguồn gốc từ thai nhi trong huyết tương của mẹ. Phần lớn cffDNA có trong huyết tương của mẹ bắt nguồn từ các tế bào lá nuôi phôi trong nhau thai. Xét nghiệm NIPT có thể sàng lọc phát hiện một số bất thường lệch bội nhiễm sắc thể: Trisomy 21 gây hội chứng: Down, Trisomy 18 gây hội chứng Edwards, Trisomy 13 gây hội chứng Patau, Hội chứng Turner, Klinefelter... Mặc dù là xét nghiệm có độ chính xác cao nhưng xét nghiệm vẫn chỉ mang giá trị sàng lọc do vật chất di truyền của thai nhi vào trong máu mẹ có thể không đại diện cho thai nhi.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 02 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 02 người.

2.2. Vật tư:

- Kit tách chiết DNA ngoại bào (cffDNA: Extract cell free DNA isolation kit (CE-IVD);

- Nước khử ion dùng cho Sinh học Phân tử;

- Ethanol dùng SHPT;

- Nước khử DNA;

- Hóa chất tạo thư viện (tạo thư viện, tinh sạch thư viện);

- Hóa chất định lượng thư viện;

- Hóa chất khuếch đại thư viện;

- Hóa chất chạy giải trình tự NIPT;

- Micropipette 2-10, 10-100, 100-1000 µL;

- Đầu côn trắng, vàng, xanh;

- Ống thu mẫu các loại thể tích;

- Ống PCR;

- Bộ ông thu máu Streck bao gồm ống EDTA, Kim tiêm vô trùng (BD), Ống giữ ống thu máu (BD);

- Hộp bông cồn sát khuẩn;

- Găng tay vô khuẩn;

- Panh kẹp;

- Khẩu trang y tế;

- Dây garo, đệm kê tay.

2.3. Trang thiết bị

- Máy giải trình tự gen thế hệ mới (NextSeq, Miseq, Seq4000, ion proton, Ion S5…);

- Máy luân nhiệt PCR;

- Máy lắc ống falcon 15mL;

- Vortex;

- Máy ly tâm ống 10 mL tốc độ 16rcf;

- Máy lắc ổn nhiệt;

- Máy định lượng DNA;

- Rack từ;

- Máy ly tâm ống thu mẫu 1,5 mL.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Chuẩn bị người bệnh: người bệnh được giải thích về việc lấy mẫu bệnh phẩm, hướng dẫn người bệnh phối hợp để lấy mẫu theo đúng yêu cầu.

- Loại mẫu bệnh phẩm: mẫu máu.

- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu, bảo quản: Hộp lấy mẫu bao gồm kim lấy mẫu chân không, ông chân không chống đông EDTA.

- Điều kiện bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm: bảo quản ở nhiệt độ phòng (25°C) không quá 60h.

- Tiêu chuẩn mẫu bệnh phẩm (thể tích, số lượng, chất lượng…): máu được lấy vào ống chân không đủ từ 7 - 10 mL.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu xét nghiệm: Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên, tuổi, giường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán...

- Kiểm tra lại các thủ tục hành chính theo quy định.

- Kiểm tra lại chỉ định/chống chỉ định (nếu có).

- Kiểm tra họ tên, tuổi, thông tin thai phụ.

- Kiểm tra lại các xét nghiệm cần thiết.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật (ước tính, đơn vị là giờ): 120 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử.

3. AN TOÀN

Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo quy trình an toàn sinh học.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện kỹ thuật

Nguyên lý:

- Tách huyết tương từ mẫu máu toàn phần.

- Tách chiết DNA ngoại bào.

- Chuẩn bị thư viện giải trình tự.

- Giải trình tự và xử lý dữ liệu.

Quy trình: tùy theo các loại hóa chất và khác nhau sẽ có các bước thực hiện thay đổi tương đương.

Đối với hệ thống NGS tự động hoàn toàn

Quy trình xét nghiệm sẽ tuân theo các bước như hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn của bộ kít. Thường bao gồm các bước như sau:

- Nạp mẫu DNA hoặc sản phẩm PCR...vào cartridge/ hộp hóa chất theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Khai báo thông tin mẫu và chọn bộ xét nghiệm trên phần mềm điều khiển tự động.

- Hệ thống thực hiện tự động các bước: Khuếch đại và/hoặc phân mảnh DNA (tùy theo kít); Gắn index và adapter; Tinh sạch thư viện, định lượng nội bộ và chuẩn bị thư viện; Tiến hành giải trình tự và phân tích kết quả tự động bằng phần mềm phân tích chuyên dụng để nhận diện các biến thể gen.

- Đối chiếu kết quả với cơ sở dữ liệu tham chiếu và tiêu chuẩn báo cáo. Lập báo cáo kết quả.

Đối với hệ thống NGS thủ công/ bán tự động

Tùy theo từng hãng và từng bộ kít sẽ có quy trình chi tiết khác nhau theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nhưng về cơ bản sẽ bao gồm các bước như sau:

4.1.1 Bước 1. Tách huyết tương từ mẫu máu toàn phần

- Ly tâm ống máu với tốc độ 2000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng 25ºC.

- Hút lớp huyết tương phía trên, chú ý thực hiện một cách nhẹ nhàng không lấy phần buffy coat.

- Ly tâm huyết tương vừa thu được.

- Hút thu dịch nổi (thực hiện một cách nhẹ nhàng).

- Giữ mẫu huyết tương trong tủ -80°C.

4.1.2 Bước 2. Tách chiết DNA ngoại bào

Xử lý mẫu trước khi tách chiết

- Thêm 15 µL proteinase K vào 1mL mẫu.

- Thêm tiếp 50 µL dịch SDS 20%, vortex mạnh.

- Ủ tại 60°C trong 60 phút.

- Ngay lập tức ủ trên đá lạnh trong 5 phút để hạ nhiệt độ mẫu về nhiệt độ phòng.

- Tách chiết DNA ngoại bào (cfDNA) từ huyết tương của mẹ.

- Chuyển toàn bộ mẫu plasma sau khi ủ vào ống falcon đã có sẵn 1,25 mL dung dịch Lysis và 15 µL dung dịch bead tách chiết, đảo ống 10 lần và đặt lên máy lắc mẫu trong 10 phút.

- Chuyển toàn bộ hỗn hợp trong ống falcon vào tube 2 mL, và đặt trên giá từ.

- Hút bỏ phần dịch nổi, thêm vào 500 µL Wash.

- Vortex tube 30s, ly tâm nhẹ, chuyển toàn bộ hỗn hợp sang tube 1,5 mL.

- Đặt tube 1,5 mL lên giá từ, hút bỏ dịch nổi, thêm vào 500 µL Wash.

- Vortex 30s, ly tâm nhẹ, đặt tube lên giá từ.

- Hút bỏ dịch nổi, thêm 1mL Ethanol 100%.

- Vortex 30s, ly tâm nhẹ, đặt tube lên giá từ.

- Hút bỏ dịch nổi, thêm 1mL Ethanol 100%.

- Vortex 30s, ly tâm nhẹ, đặt tube lên giá từ.

- Hút bỏ toàn bộ dịch nổi, ly tâm tube, hút sặn phần dịch còn lại.

- Chờ cho hạt bead vừa khô, thêm vào 30 µL dung dịch Elution Buffer.

Định lượng cfDNA:

- Định lượng cfDNA bằng phương pháp đo huỳnh quang.

- Chuẩn bị dung dịch định lượng:

+ Dung dịch TE (188,1 µL H2O + 9,9 µL TE 20X), trộn đều ống.

+ Hút bỏ đi 0,5 µL dung dịch TE, thêm 0,5 µL thuốc nhuộm, trộn đều ống.

- Cho 2 µL mẫu sau khi tách chiết vào ống đã chứa sẵn 198 µL dung dịch đó.

- Trộn đều ống.

- Để yên ống trên giá, tránh ánh sáng trong 5 phút.

- Cho ống vào máy định lượng, chọn chương trình đo gDNA với mức thể tích là 2 µL.

- Tiêu chuẩn tối thiểu cần đạt: Nồng độ DNA sau khi tách chiết tối thiểu cần đạt là 0,1 ng/µL.

- Nếu không tiến hành bước tiếp theo, dịch DNA được trữ ở -20ºC.

4.1.3 Bước 3. Chuẩn bị thư viện giải trình tự

Sửa sai đầu mút DNA:

- 17 µL của cfDNA được li trích ở trên sẽ được trộn với 2,5 µL End prep buffer và 1 µL Endprep enzyme mix.

- Phản ứng được ủ ở 30 phút tại 20°C và 30 phút tại 65°C.

Nối với adaptor:

- 21 µL từ phản ứng trên sẽ được tiếp tục trộn với 10 µL Ligation master mix, 0,3 µL Ligation enhancer và 0,8 µL adaptor.

- Phản ứng được ủ tại 20°C trong 15 phút.

- Thêm 1 µL USER enzyme.

- Trộn mẫu và ủ tại 37°C trong 15 phút.

Tinh sạch DNA

- Trộn đều hạt beads bằng máy vortex.

- Thêm 48 µL beads, trộn đều.

- Để tại nhiệt độ phòng trong 5 phút.

- Thêm 200 µL ethanol 80%.

- Ủ tại nhiệt độ phòng trong 30 giây.

- Đặt mẫu lên giá tách từ.

- Loại bỏ huyền phù.

- Thêm ethanol 80% để lập lại bước rửa lần thứ 2.

- Thêm 30 µL 10 mM Tris-HCl để dung giải DNA khỏi hạt bead.

- Đặt mẫu trên giá tách từ.

- Chuyển dịch dung giải DNA sang ống tube mới. Khuếch đại DNA bằng PCR:

- Trộn 9 µL DNA được tinh sạch với 13 µL PCR master mix 2X và 3 µL của mỗi primer.

- Thực hiện phản ứng PCR với quy trình sau:

- Bảo quản sản phẩm PCR tại -20°C.

- Tinh sạch sản phẩm PCR.

- Trộn hạt beads.

- Thêm 48 µL bead vào mẫu, trộn đều.

- Để tại nhiệt độ phòng trong 5 phút.

- Thêm 200 µL ethanol 80%.

- Ủ tại nhiệt độ phòng trong 30 giây.

- Đặt mẫu lên giá tách từ.

- Loại bỏ huyền phù.

- Thêm ethanol 80% để lập lại bước rửa lần thứ 2.

- Thêm 30 µL 10 mM Tris-HCl để dung giải DNA khỏi hạt bead.

- Đặt mẫu trên giá tách từ.

- Chuyển dịch dung giải DNA sang ống tube mới.

- Định lượng cfDNA.

Biến tính và pha loãng thư viện DNA:

- Sản phẩm PCR được tinh sạch sẽ được pha loãng bằng 10mM Tris-HCl đến 10 nM và sau đó là 1nM.

- Trộn 5 µL sản phẩm PCR tại nồng độ 1nM với 5 µL NaOH 0,1N.

- Ủ tại nhiệt độ phòng trong 5 phút.

- Thêm 5 µL Tris-HCl 200 mM.

- Thêm 985 µL hybridization.

- Tiếp tục pha loãng sản phẩm PCR đến nồng độ 1,4 pM bằng cách trộn 140 µL sản phẩm PCR đã pha loãng từ bước trên với 360 µL hybridization buffer.

Trước khi giải trình tự gen, thư viện DNA sau khi tạo ra phải đảm bảo các yêu cầu chất lượng nhất định để phân tích kết quả được chính xác, bao gồm:

- Tỷ lệ DNA của thai nhi cần phải đủ cao để phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể đang tin cậy, > 4%.

- Các đoạn DNA thai nhi có phân bố kích thước đặc trưng, thường nằm trong phạm vi từ 150 - 200 bp.

4.1.4 Bước 4. Giải trình tự và xử lý dữ liệu.

- Giải trình tự thế hệ mới:

- 500 µL thư viện DNA sau khi đã được biến tính và pha loãng sẽ được bơm lên hộp hóa chất giải trình tự.

- Quá trình giải trình tự được tiến hành tự động trên hệ thống máy giải trình tự thế hệ mới.

- Phân tích kết quả giải trình tự:

- Chất lượng của tín hiệu giải trình tự được đánh giá dựa trên điểm chất lượng tương ứng.

- Kết quả giải trình tự sẽ được xuất dưới định dạng FASTQ và được so sánh với bộ gen người để định vị các phân mảnh DNA tự do được giải trình tự trên các NST. Sau đó, số lượng các phân mảnh DNA tự do trên mỗi NST mục tiêu sẽ được xác định. Nếu mẫu bị lệch bội, số lượng phân mảnh DNA tự do trên NST đó sẽ gia tăng so với tập hợp các mẫu bình thường. Đây là phương pháp đếm số lượng các DNA tự do được sử dụng phổ biến trong nhiều bộ kit thương mại.

4.2. Nhận định kết quả

Kết quả của người bệnh chỉ được báo cáo khi kết quả của người bệnh và kết quả của mẫu chứng trong xét nghiệm đạt các chỉ tiêu chấp nhận của phòng thí nghiệm (giá trị chỉ số Z-score phù hợp với từng hãng sản xuất tương ứng), có chứng chỉ CE-IVD.

- z-score <2: mẫu bình thường.

- 2< z-score <3: mẫu bị nghi ngờ.

- z-score >3: mẫu bệnh.

- Riêng trường hợp monosomy X thì zscore <-3.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét nghiệm.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

- Sai sót:

+ Mẫu máu không đảm bảo cho việc xét nghiệm (tan huyết hoặc bị đông mẫu máu, hàm lượng cfDNA không đủ để phân tích).

+ Mẫu để quá lâu gây thoái biến DNA, người bệnh có truyền máu, người bệnh có bị K, người bệnh có thai đôi tiêu biến, người bệnh sử dụng thuốc nội tiết.

- Xử trí: Lấy lại mẫu (nếu cần thiết khi các chỉ số phân tích không đạt).

5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật

- Sai sót:

+ Những mẫu có nồng độ tách chiết không đạt.

+ Những mẫu có nồng độ PCR không đạt.

+ Những mẫu có nồng độ cffDNA thấp hơn theo tiêu chuẩn của kỹ thuật.

+ Những mẫu có tín hiệu nhiễu và nghi ngờ (cần lấy lại mẫu sau 1 tuần dừng thuốc).

- Xử trí: Lấy lại mẫu (nếu cần thiết).

5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật

- Sai sót:

+ Kết quả thấy có nghi ngờ (nằm ở ranh giới giữa nguy cơ cao và nguy cơ thấp) hoặc có thể chưa phù hợp với kết quả siêu âm.

- Xử trí:

+ Cần tiếp tục siêu âm theo dõi sự phát triển hình thái của thai nếu kết quả trả về là (âm tính, nguy cơ thấp).

+ Cần chọc ối để chẩn đoán chính xác bất thường của nhiễm sắc thể nếu kết quả trả về là dương tính, nguy cơ cao, nghi ngờ nguy cơ cao.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

- Bảo dưỡng máy định kỳ hàng ngày, hàng tuần và hàng tháng theo quy định.

- Hóa chất, vật tư trước khi đưa vào sử dụng cần được kiểm tra/đánh giá theo quy định, đảm bảo chất lượng và đủ cơ số hóa chất, vật tư để thực hiện xét nghiệm.

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bianchi DW, Parker RL, Wentworth J, et al. DNA sequencing versus standard prenatal aneuploidy screening. N Engl J Med. 2014;370(9):799-808.

2. Genetic Disorders and the Fetus. Aubrey Milunsky and Jeff Milunsky. JohnWiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey. Seventh edition. 2002

3. Gregg AR, Skotko BG, Benkendorf JL, et al. Noninvasive prenatal screening for fetal aneuploidy, 2016 update: a position statement of the American College of Medical Genetics and Genomics. Genet Med. 2016;18(10):1056-1065.

4. Lynn B. Jorde et al. Medical genetics, fifth edition, 2020, ISBN

5. Mardis ER. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev AnalChem (Palo Alto Calif). 2013

6. Norton ME, Jacobsson B, Swamy GK, et al. Cell-free DNA analysis for noninvasive examination of trisomy. N Engl J Med. 2015;372(17):1589-1597.

7. Strachan T, Read AP. Human Molecular Genetics. 4th ed. New York: Garland Science; 2010.

2. XÉT NGHIỆM GEN TRƯỚC SINH KHÔNG XÂM LẤN BẰNG KỸ THUẬT NGS

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Xét nghiệm gen trước sinh không xâm lấn bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới - NGS (Next Generation Sequencing) nhằm phát hiện một số bất thường di truyền ở mức độ gen có thể có ở thai.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Trong quá trình mang thai, một lượng DNA của nhau thai được giải phóng và di chuyển tự do trong máu mẹ, được gọi là DNA tự do (cell-free DNA, cfDNA). Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS - Next Generation Sequencing) giúp phân tích cfDNA để sàng lọc các bất thường di truyền ở mức độ gen của thai nhi.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 02 người.

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 02 người.

2.2. Vật tư:

- Hoá chất sinh phẩm: Bộ kit tách chiết cfDNA, bộ kit chuẩn bị thư viện cho giải trình tự, bộ kit giải trình tự.

- Vật tư:

+ Đầu côn 10 µL, 20 µL, 100 µL và 1000 µL;

+ Ống thu mẫu 1,5 mL, ống thu mẫu 0,2 mL;

+ Falcon;

+ Khẩu trang;

+ Găng tay vô trùng;

+ Găng tay xử lý dụng cụ, quần áo bảo hộ, dung dịch nước rửa tay, cồn sát khuẩn tay nhanh, dung dịch khử trùng, khăn lau tay;

+ Giấy thấm, giấy xét nghiệm, sổ lưu kết quả xét nghiệm, bút viết kính, bút bi.

2.3. Trang thiết bị:

+ Máy PCR;

+ Máy ly tâm;

+ Máy vortex;

+ Máy đo nồng độ DNA;

+ Micropipette;

+ Máy giải trình tự;

+ Server phân tích và lưu trữ dữ liệu.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Loại mẫu bệnh phẩm: máu ngoại vi.

- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu, bảo quản: ống Streck.

- Điều kiện bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm: điều kiện nhiệt độ phòng, trong vòng 7 ngày.

- Tiêu chuẩn mẫu bệnh phẩm (thể tích, số lượng, chất lượng…):

+ Ống máu không có tình trạng nứt, đổ bể.

+ Ống máu phải thu đúng bộ kit được cung cấp.

+ Ống máu được bảo quản theo tiêu chuẩn của bộ kit cung cấp.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật (ước tính, đơn vị là giờ): đối với 1 mẫu: 47-83 giờ

- Nhận và xử lý mẫu: 1 giờ.

- Tách chiết: 2 giờ.

- Thư viện: 8 giờ.

- Giải trình tự: 12 - 24 giờ (tuỳ vào kit sử dụng).

- Phân tích dữ liệu: 12 - 24 giờ (tuỳ vào công cụ phân tích và phần cứng máy tính).

- Đánh giá kết quả: 12 - 24 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Các phòng xét nghiệm đủ điều kiện thực hiện kỹ thuật.

3. AN TOÀN

- Nhân viên thực hiện thao tác trên mẫu đều phải mặc áo lab, mang găng tay, đeo khẩu trang, và kính bảo hộ mắt.

- Các hoá chất, dung dịch sau xét nghiệm được thu hồi vào bình chứa chất thải lỏng có dán nhãn nguy hiểm sinh học, các chất thải rắn sau xét nghiệm được phân loại theo Quy trình xử lý và phân loại chất thải.

- Tuân thủ các nội quy, quy định và hướng dẫn thuộc An toàn Sinh học.

4.CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

4.1.1 Bước 1. Nhận bệnh phẩm và xử lý mẫu: kiểm tra thông tin trên mẫu bệnh phẩm với phiếu xét nghiệm).

- Xử lý mẫu: Quy trình trải qua hai bước ly tâm.

+ Ly tâm lần 1 (1600g, thu nhận huyết tương lần 1 trong tube 1,5 mL).

+ Ly tâm lần 2 (12000g, thu nhận huyết tương lần 2 trong tube 1,5 mL, bỏ cặn ly tâm).

4.1.2 Bước 2. Chuẩn bị dụng cụ, hoá chất (nếu có).

- Chuẩn bị đầu tip vô trùng (đã hấp khử trùng và sấy khô, hoặc dùng tip vô trùng đóng gói sẵn).

- Pha các hóa chất quy trình trong tủ an toàn sinh học cấp 2 hoặc phòng sạch dùng cho pha hóa chất.

4.1.3 Bước 3. Đánh giá QC.

Mẫu plasma sau khi ly tâm cần QC tình trạng tiêu máu, và có thể cần thu mẫu lại nếu cần thiết.

4.1.4 Bước 4. Tiến hành kỹ thuật (Các bước thực hiện kỹ thuật).

- Tách chiết cfDNA từ mẫu plasma theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit.

Đối với hệ thống NGS tự động hoàn toàn

Quy trình xét nghiệm sẽ tuân theo các bước như hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn của bộ kít. Thường bao gồm các bước như sau:

- Nạp mẫu DNA hoặc sản phẩm PCR...vào cartridge/ hộp hóa chất theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Khai báo thông tin mẫu và chọn bộ xét nghiệm trên phần mềm điều khiển tự động.

- Hệ thống thực hiện tự động các bước: Khuếch đại và/hoặc phân mảnh DNA (tùy theo kít); Gắn index và adapter; Tinh sạch thư viện, định lượng nội bộ và chuẩn bị thư viện; Tiến hành giải trình tự và phân tích kết quả tự động bằng phần mềm phân tích chuyên dụng để nhận diện các biến thể gen.

- Đối chiếu kết quả với cơ sở dữ liệu tham chiếu và tiêu chuẩn báo cáo. Lập báo cáo kết quả.

Đối với hệ thống NGS thủ công/ bán tự động

Tùy theo từng hãng và từng bộ kít sẽ có quy trình chi tiết khác nhau theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nhưng về cơ bản sẽ bao gồm các bước như sau:

- Chuẩn bị thư viện trên mẫu cfDNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit.

- Định lượng thư viện cfDNA bằng huỳnh quang (Qubit, Quantifluor) và chuẩn hóa (normalize) nồng độ thư viện tất cả các mẫu trước khi giải trình tự.

- Giải trình tự trên mẫu thư viện đã chuẩn bị.

+ Các mẫu thư viện được gộp chung (pooling) và được biến tính (denatured).

+ Thư viện sau đó được pha loãng về nồng độ trước khi nạp vào cartridge

+ Quá trình giải trình tự trải qua 2 bước chính: tạo cụm (clustering) và giải trình tự (sequencing).

+ Đánh giá các thông số chất lượng giải trình tự.

+ Phân tích dữ liệu giải trình tự.

4.2. Nhận định kết quả

- Báo cáo kết quả giải trình tự và phân loại biến thể

- Kết quả âm tính: Không phát hiện các biến thể gây bệnh/có khả năng gây bệnh trên các gen được khảo sát.

- Kết quả dương tính: Phát hiện các biến thể gây bệnh/có khả năng gây bệnh có tần suất thấp không có trong gDNA của mẹ.

- Đối với những mẫu có kết quả bất thường: nếu mẫu không đạt được các tiêu chuẩn của quy trình xét nghiệm sẽ được tiến hành lập lại để tìm ra nguyên nhân.

- Trị số bình thường: khi mẫu đạt được tất cả các tiêu chuẩn của bước thu mẫu, tách chiết cfDNA, tạo thư viện và giải trình tự.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét nghiệm.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

- Sai sót:

+ Mẫu máu có đảm bảo cho việc xét nghiệm không (tan huyết hoặc bị đông mẫu máu, hàm lượng cfDNA không đủ để phân tích).

+ Mẫu để quá lâu gây thoái biến DNA, người bệnh có truyền máu, người bệnh có bị K, người bệnh có thai đôi tiêu biến, người bệnh sử dụng thuốc nội tiết.

- Xử trí: Lấy lại mẫu (nếu cần thiết khi các chỉ số phân tích không đạt).

5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật

- Sai sót:

+ Những mẫu có nồng độ tách chiết <0,1 ng/µL sẽ không được thực hiện.

+ Những mẫu có nồng độ PCR <2 ng/µL sẽ không được giải trình tự.

+ Những mẫu có nồng độ cffDNA nhỏ hơn 2%.

+ Những mẫu có tín hiệu nhiễu và nghi ngờ (cần lấy lại mẫu sau 1 tuần dừng thuốc).

- Xử trí: Lấy lại mẫu (nếu cần thiết).

5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật

- Sai sót: Kết quả thấy có nghi ngờ (nằm ở ranh giới giữa nguy cơ cao và nguy cơ thấp) hoặc có thể chưa phù hợp với kết quả siêu âm.

- Xử trí:

+ Cần tiếp tục siêu âm theo dõi sự phát triển hình thái của thai nếu kết quả trả về là (âm tính, nguy cơ thấp)

+ Cần chọc ối để chẩn đoán chính xác bất thường nhiễm sắc thể của thai nếu kết quả trả về là dương tính, nguy cơ cao, nghi ngờ nguy cơ cao.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Chitty LS, Mason S, Barrett AN, McKay F. Non-invasive prenatal diagnosis of achondroplasia and thanatophoric dysplasia: next-generation sequencing allows for a safer, more accurate, and comprehensive approach. Jul 2015;35(7):656-662.

2. Shaw J, Scotchman E, Chandler N, Chitty LS. PREIMPLANTATION GENETIC TESTING: Non-invasive prenatal testing for aneuploidy, copy- number variants and single-gene disorders. Reproduction (Cambridge, England). Nov 2020;160(5):A1-a11.

3. Zhang J, Li J, Saucier J, et al. Non-invasive prenatal sequencing for multiple Mendelian monogenic disorders using circulating cell-free fetal DNA. Nature Medicine. 03/01 2019;25

4. Mohan P, Lemoine J, Trotter C, et al. Clinical experience with non- invasive prenatal screening for single-gene disorders (NIPT-SGD). Aug 6 2021.

3. XÉT NGHIỆM TẠP NHIỄM MÁU MẸ TRONG DỊCH ỐI BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ĐOẠN DNA TRÊN ĐIỆN DI MAO QUẢN

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Xác định tạp nhiễm máu mẹ trong dịch ối trong chẩn đoán trước sinh các bệnh lý di truyền.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

- Tạp nhiễm máu mẹ trong quá trình chọc hút dịch ối là nguy cơ dẫn đến sai lệch kết quả xét nghiệm chẩn đoán trước sinh. Do đó, xác định tạp nhiễm máu (tế bào) của mẹ trong dịch ối là cần thiết trước khi tiến hành chẩn đoán di truyền cho thai nhi với mẫu tế bào ối.

- Sử dụng kỹ thuật phân tích DNA với chỉ thị di truyền STR và kỹ thuật QF-PCR có thể để định danh nguồn gốc của tế bào trong mẫu. Trường hợp mẫu ối có lẫn tế bào máu của mẹ, kết quả phân tích STR sẽ cho thấy kết quả DNA đến từ 2 nguồn khác nhau. Ngược lại, kết quả phân tích STR sẽ cho kết quả DNA từ duy nhất 1 nguồn mẫu của thai nhi.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 02 người

2.2. Vật tư sinh phẩm

2.3. Trang thiết bị

- Tủ an toàn sinh học cấp II;

- Máy ly tâm ống máu thể tích 10mL (EDTA/ Streck tube);

- Máy ly tâm lạnh cho ống 2mL/1,5mL (2-8 °C);

- Máy vortex, máy spindown;

- Tủ lạnh 2°C - 8°C;

- Tủ lạnh âm sâu (-20°C đến -80°C);

- Giá từ loại 0,2 mL và 1,5mL;

- Pipet các loại 2, 10, 100, 200, 1000 µL;

- Đồng hồ hẹn giờ;

- Máy PCR;

- Máy giải trình tự gen Sanger hoặc tương đương và thiết bị đi kèm.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Bệnh phẩm là máu ngoại vi, dịch hút tủy xương, chống đông (ống EDTA K2/K3).

- Mẫu máu ổn định khi lưu trữ ở nhiệt độ phòng trong 24h hoặc 1 tuần ở điều kiện 2-8°C.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật

Ước tính từ lúc bắt đầu cho đến khi kết thúc xét nghiệm: 48-72 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Phòng xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử.

3. AN TOÀN

- Nhân viên phải mang găng tay, khẩu trang và mặc trang phục y tế trong suốt quá trình làm xét nghiệm.

- Phân loại đúng rác thải và loại bỏ rác thải ngay sau quá trình thực hiện xét nghiệm.

- Thực hiện kiểm soát điều kiện môi trường theo “Quy trình theo dõi và kiểm soát điều kiện môi trường”.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

4.1.1 Tách chiết DNA

- Tách chiết DNA tổng số sử dụng bộ sinh phẩm và theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Mẫu DNA có thể lưu ở 2-8°C trong 24h và lưu trữ lâu hơn ở -20 °C.

4.1.2. Thực hiện phản ứng PCR

- Khuếch đại các vùng gen đích mã hóa các locus STR bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu.

- Chuẩn bị master mix và chạy PCR theo hướng dẫn quy trình của nhà sản xuất.

4.1.3. Điện di mao quản, phân tích đoạn DNA

- Sử dụng kit QF-PCR và điện di mao quản theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Điện di trên máy Sanger sequencing.

4.2. Phân tích và nhận định kết quả

- Đánh giá kết quả chạy dựa trên các thông số giải trình tự gen.

- Xuất kết quả từ máy và thực hiện phân tích trên phần mềm tin sinh học.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét nghiệm.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

Kiểm soát các mẫu chứng (hoặc IC) theo hướng dẫn đi kèm bộ sinh phẩm sử dụng.

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. QIAGEN (2016) Protocol of QIAamp DNA Blood Mini Kit.

2. Prenatal Diagnosis, second edition, Humana Press 2019.

4. XÉT NGHIỆM BIẾN THỂ GEN BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ĐOẠN DNA TRÊN ĐIỆN DI MAO QUẢN

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Xác định các biến đổi di truyền bằng kỹ thuật phân tích đoạn DNA bằng điện di mao quản phục vụ chẩn đoán, tiên lượng và điều trị bệnh.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Kỹ thuật này là kỹ thuật kết hợp PCR với điện di mao quản để phân tích đoạn DNA dựa trên độ dài của sản phẩm PCR.

Sử dụng các probe đặc hiệu dùng để phát hiện các biến đổi di truyền lớn (mất đoạn và lặp đoạn gen). Mỗi probe gồm hai oligonucleotide gắn trực tiếp trên trình tự đích, có chiều dài khuếch đại duy nhất, thường dao động trong khoảng 64-500 nucleotide. Sau khi biến tính sợi khuôn, hỗn hợp probe được thêm vào để phản ứng lai giữa probe và sợi khuôn được diễn ra. Tiếp đến, sản phẩm lai được sử dụng để làm khuôn cho phản ứng PCR. Tất cả các probe đã lai được khuếch đại đồng thời với cùng một cặp mồi PCR. Probe được đánh dấu huỳnh quang do đó cho phép các sản phẩm khuếch đại được phát hiện qua phân tích đoạn bằng thiết bị điện di mao quản, từ đó phát hiện được sự lặp lại hoặc xóa đoạn trình tự gen

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 01 người.

2.2. Vật tư

2.3. Trang thiết bị

- Máy PCR;

- Máy tính có phần mềm phân tích dữ liệu;

- Hệ thống máy giải trình tự ABI3500;

- Bộ lưu điện;

- Máy trộn mẫu;

- Máy ly tâm loại để bàn;

- Tủ an toàn sinh học cấp II;

- Máy ủ nhiệt kèm lắc rung;

- Máy Vortex;

- Máy ly tâm Spin down;

- Tủ lạnh 2°C-8°C;

- Tủ lạnh âm sâu -20°C;

- Tủ lạnh âm sâu -70°C.

- Bộ pipet các kích cỡ từ 1 µL đến 1000 µL.

- Phần mềm quản lý xét nghiệm;

- Máy hút ẩm;

- Bồn rửa mắt và tắm khẩn cấp.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm là 1-2 mL máu toàn phần/tủy xương đựng trong ống chống đông EDTA. Bảo quản 2-8°C, giao mẫu đến khoa xét nghiệm trong vòng 24 giờ kể từ khi lấy mẫu.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật

Ước tính từ lúc bắt đầu cho đến khi kết thúc xét nghiệm: 24 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Phòng xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử.

3. AN TOÀN

- Nhân viên phải mang găng tay, khẩu trang và mặc trang phục y tế trong suốt quá trình làm xét nghiệm.

- Phân loại đúng rác thải và loại bỏ rác thải ngay sau quá trình thực hiện xét nghiệm.

- Thực hiện kiểm soát điều kiện môi trường theo “Quy trình theo dõi và kiểm soát điều kiện môi trường”.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

4.1.1 Tách chiết DNA

Sử dụng các bộ kít thương mại, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

4.1.2. Đo nồng độ DNA

Thực hiện các bước kỹ thuật theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

4.1.3. Biến tính DNA khuôn

- Chuẩn bị hồ sơ xét nghiệm;

- Thực hiện biến tính DNA khuôn theo hướng dẫn đi kèm bộ kit;

- Đặt các ống phản ứng vào máy PCR và chạy theo chương trình tương ứng.

4.1.4. Thực hiện phản ứng lai

- Chuẩn bị ống phản ứng;

- Thực hiện các bước lai theo hướng dẫn đi kèm.

4.1.5. Thực hiện phản ứng nối

- Chuẩn bị ống phản ứng;

- Thực hiện các bước lai theo hướng dẫn đi kèm.

4.1.6. Thực hiện phản ứng PCR

- Chuẩn bị ống phản ứng;

- Thực hiện các bước PCR theo hướng dẫn đi kèm.

4.1.7 Điện di trên hệ thống ABI3500

- Chuẩn bị máy ABI3500:

+ Bật máy trước 1giờ.

+ Cài đặt sơ đồ mẫu.

- Biến tính mẫu: thực hiện theo hướng dẫn đi kèm bộ kit.

- Nhỏ mẫu vào plate theo đúng vị trí đã cài đặt trên máy.

- Đặt plate vào khay chạy mẫu và đặt khay vào đúng vị trí trên hệ thống AB3500.

- Chọn chương trình phù hợp và bấm “Start Run” để bắt đầu chương trình chạy.

4.2. Nhận định kết quả

Nhận diện mẫu có kết quả bình thường, có đột biến mất đoạn hay lặp đoạn gen dựa theo hướng dẫn đi kèm bộ sinh phẩm sử dụng.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét nghiệm.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

Đánh giá chất lượng mẻ chạy theo các tiêu chí được quy định trong hướng dẫn đi kèm bộ sinh phẩm sử dụng.

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Kim, J. J., Lee, K. S., Lee, T. G., et al. (2022). A comparative study of next-generation sequencing and fragment analysis for the detection and allelic ratio determination of FLT3 internal tandem duplication. Diagnostic Pathology, 17, 14.

2. Lorenz, T. C. (2012). Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments 63:e3998.

5. XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI/TRƯỚC LÀM TỔ (PGT) BẰNG KỸ THUẬT NGS

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Kỹ thuật xét nghiệm di truyền trước làm tổ bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS - Next Generation Sequencing) nhằm phát hiện đồng thời biến thể gây bệnh di truyền đơn gen và các lệch bội nhiễm sắc thể của phôi.

1.2. Định nghĩa

Xét nghiệm di truyền trước làm tổ (PGT - Preimplantation genetic testing) bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS - Next Generation Sequencing), còn gọi là kỹ thuật PGT-plus, bao gồm PGT-M kết hợp PGT-A. PGT plus là kỹ thuật phát hiện đồng thời biến thể gen gây bệnh và bất thường số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể trên phôi bào nhằm mục đích sàng lọc phôi bình thường để chuyển vào tử cung mẹ, tránh chuyển các phôi bất thường di truyền, tăng tỷ lệ thành công trong IVF-ICSI. Xét nghiệm sử dụng một số tế bào sinh thiết phôi để khuếch đại toàn bộ hệ gen (WGA), cung cấp đủ mẫu DNA để xây dựng và giải trình tự thư viện. Sử dụng sinh tin học so sánh tỷ lệ trình tự nhiễm sắc thể được tạo ra trong tế bào mẫu phôi với các chuỗi được tạo ra trong một bảng tham chiếu các tế bào, cho phép tính toán số bản sao nhiễm sắc thể (CNV) trong tế bào mẫu thử.

Xét nghiệm NGS dựa trên nguyên tắc giải trình tự song song (parallel sequencing), trong đó hàng triệu đoạn DNA được giải trình tự đồng thời, giải trình tự thế hệ mới cho phép giải được từ 8Gbases đến 600Gbases, cho phép giải trình tự trên cùng một mẫu tế bào phôi để phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể và các biến thể gây bệnh.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 02 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 02 người.

2.2. Vật tư

- Bộ kit nhân bản toàn bộ hệ gen từ một vài tế bào (WGA) tùy hãng.

- PGS Kit for PGT-A.

- PGD-SEQ kits for PGT-M.

- Nước khử ion.

- Mastermix.

- Ống li tâm đáy nhọn dung tích 1,5 -2 mL.

- Đầu côn các loại: 10 µL, 100 µL, 1000 µL.

- PCR tube.

- Plate PCR 96 giếng.

- Găng tay.

- Khẩu trang.

2.3. Trang thiết bị

- Máy ủ nhiệt có lắc.

- Máy Vortex.

- Máy ly tâm.

- Máy đo độ tinh sạch.

- Máy spin down.

- Máy Speedvac.

- Bộ dụng cụ pippet: micropippet, pippet 100 µL và pippet 1000 µL.

- Buồng thao tác PCR.

- Máy PCR.

- Hệ thống giải trình tự thế hệ mới tương thích với từng loại kit.

- Phần mềm phân tích kết quả tương thích cho từng hệ thống.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Chuẩn bị người bệnh: Gia đình được giải thích cặn kẽ về việc lấy mẫu sinh thiết phôi ngày 5 làm xét nghiệm PGT-M bằng cách lấy từ 5 đến 7 tế bào lá nuôi của phôi. Việc sinh thiết này không làm ảnh hưởng đến chất lượng phôi.

- Loại mẫu bệnh phẩm: mẫu phôi.

- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu, bảo quản: Tế bào (phôi 5 ngày) được thu vào ống PCR cùng với một lượng tối thiểu dung dịch PBS 1X sao cho thể tích sau khi chuyển chỉ là 2,5 μl.

- Điều kiện bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm: bảo quản ở nhiệt độ phòng (25°C) không quá 24 giờ.

- Tiêu chuẩn mẫu bệnh phẩm (thể tích, số lượng, chất lượng…): tế bào phôi được lấy vào ống PCR sạch 0,2 mL, đủ 2,5 μl. Ống đựng tế bào phôi sinh thiết luôn phải đặt ở trạng thái đứng. Mẫu được lấy theo Quy trình hướng dẫn lấy mẫu tại labo IVF.

2.5. Phiếu xét nghiệm

- Kiểm tra phiếu xét nghiệm: Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về phôi: cặp vợ chồng: mã số phôi, họ tên vợ và chồng, tuổi, chẩn đoán lâm sàng, chỉ định xét nghiệm, ngày sinh thiết.

- Kiểm tra lại các thủ tục hành chính theo quy định.

- Kiểm tra lại chỉ định/chống chỉ định (nếu có).

- Kiểm tra họ tên, tuổi, thông tin vợ chồng.

- Kiểm tra lại các xét nghiệm cần thiết.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật

Từ 48 đến 72 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Phòng xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử

3. AN TOÀN

- Quản lý các nguồn điện, áp dụng phòng ngừa biện pháp an toàn điện chung cho các thiết bị trong phòng xét nghiệm.

- Các hóa chất thực hiện có thể là các chất nguy hại sinh học hoặc dễ gây cháy nổ, tham khảo dữ liệu an toàn của từng hoá chất để kiểm soát rủi ro có thể có.

- Các mẫu sinh học có thể có chứa nhân tố lây nhiễm sinh học, cần được coi là nguy cơ sinh học tiềm ẩn. Đảm bảo thực hiện an toàn cá nhân bằng các trang thiết bị như trang phục phòng xét nghiệm, khẩu trang, găng tay, kính mắt…

- Chú ý thao tác với các thiết bị có nhiệt độ cao như máy ủ nhiệt có lắc, máy Speedvac, máy PCR.

- Khi có sự cố cần báo cáo kịp thời để có biện pháp ngăn ngừa rủi ro và khắc phục hậu quả.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện kỹ thuật

4.1.1. Tiến hành nhân bản bộ gen của phôi (WGA - whole genome amplification) [tham khảo phụ lục]

- Tiến hành nhân bản bộ gen của phôi (WGA - whole genome amplification) bằng kít WGA dùng cho tế bào đơn (Single cell) theo quy trình của nhà sản xuất.

- Các mẫu DNA thu được sau nhân bản bộ gen phôi được tiến hành đo nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch. Mẫu DNA được pha loãng về nồng độ từ 10-20 ng/µL để thực hiện phản ứng tiếp theo.

Đối với hệ thống NGS tự động hoàn toàn

Quy trình xét nghiệm sẽ tuân theo các bước như hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn của bộ kít. Thường bao gồm các bước như sau:

- Nạp mẫu DNA hoặc sản phẩm PCR...vào cartridge/ hộp hóa chất theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Khai báo thông tin mẫu và chọn bộ xét nghiệm trên phần mềm điều khiển tự động.

- Hệ thống thực hiện tự động các bước: Khuếch đại và/hoặc phân mảnh DNA (tùy theo kít); Gắn index và adapter; Tinh sạch thư viện, định lượng nội bộ và chuẩn bị thư viện; Tiến hành giải trình tự và phân tích kết quả tự động bằng phần mềm phân tích chuyên dụng để nhận diện các biến thể gen.

- Đối chiếu kết quả với cơ sở dữ liệu tham chiếu và tiêu chuẩn báo cáo. Lập báo cáo kết quả.

Đối với hệ thống NGS thủ công/ bán tự động

Tùy theo từng hãng và từng bộ kít sẽ có quy trình chi tiết khác nhau theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nhưng về cơ bản sẽ bao gồm các bước như sau:

4.1.2. Tạo thư viện DNA

Tuỳ từng hãng mà bộ kit lập thư viện gen sẽ có từng quy trình tiến hành riêng, việc thực hiện cần đảm bảo các thao tác cẩn thận, tỉ mỉ với độ chính xác cao, quy trình chung sẽ bao gồm:

Bước 1: Cắt DNA hệ gen bằng enzyme giới hạn (DNA Fragmentation)

Sau đó ủ 37°C trong 20 phút, duy trì 4 °C.

Bước 2: Tinh sạch sản phẩm cắt DNA bằng hạt từ.

Bước 3: Sửa đầu cuối (End repair).

Bước 4: tinh sạch sản phẩm End repair và thu sản phẩm trong 40 µL TE.

Bước 5: Ghép nối (Connector connection)

Trộn đều nhẹ và ly tâm nhẹ rồi chuyển sang máy PCR ủ ở nhiệt độ 25ºC trong 30 phút và duy trì ở 4°C.

- Bước 6: Tinh sạch sản phẩm Connector connection và thu sản phẩm trong 18,5µL TE.

- Bước 7: Nhân gen bằng PCR.

Trộn đều nhẹ và ly tâm rồi chuyển sang máy PCR (72 °C trong 10 phút; 95 °C trong 5 min; 9 chu kỳ (95 °C trong 15 giây, 58 °C trong 15 giây, 70 °C trong 1 phút); 1 chu kỳ 70°C trong 5 phút, duy trì 4 °C).

Bước 8: Tinh sạch sản phẩm PCR bằng hạt từ và thu trong 50 µL TE, rồi tiến hành định lượng bằng máy realtime hoặc máy Quibit (theo kít Quibit của hãng sản xuất).

Bước 9: Chạy PCR thư viện trên máy chuẩn bị thư viện (nếu có theo quy trình của nhà sản xuất, mất khoảng 5 giờ) hoặc thủ công.

Bước 10: Giải trình tự các đoạn DNA đã gắn lên mỗi bead theo nguyên lý Ion Semiconductor hoặc nguyên lý khác tùy bộ kít.

DNA được biến tính và tiến hành giải trình tự đồng thời các gen mục tiêu trên hệ thống giải trình tự thế hệ mới và hóa chất dành cho máy giải trình tự.

Bước 11: Phân tích kết quả: Ghép nối các đoạn DNA đã giải trình tự bằng phần mềm tin sinh để tạo ra một trình tự đầy đủ của genome.

Các bước tiến hành tuân thủ theo hướng dẫn của bộ kit và nhà sản xuất.

4.2. Nhận định kết quả

- Từ phần mềm phân tích đưa ra dữ liệu và hình thái cấu trúc nhiễm sắc thể thể hiện qua hình ảnh và số liệu % khả năng xảy ra bất thường nhiễm sắc thể của phôi bào từ chạy PGS Kit for PGT-A.

- Từ phần mềm phân tích đưa ra dữ liệu kiểu gen qua di truyền liên kết của phôi bào từ chạy PGD-SEQ kits for PGT-M hoặc tương đương.

- Đánh giá tổng hợp hai kết quả và đưa ra kết luận.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

- Sai sót: Nhận nhầm mẫu.

- Xử trí: Kiểm tra thông tin mẫu, đối chiếu phiếu xét nghiệm (Double check).

5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật

5.2.1. Thao tác pipet không chính xác

- Sai sót: Thao tác pipet không chính xác ảnh hưởng đến chất lượng của xét nghiệm.

- Xử trí: Định kì kiểm tra chất lượng pipet, tiến hành thao tác với pipet cẩn thận.

5.2.2. Mẫu nhiễm DNA ngoại lai

- Sai sót: Nhiễm DNA ngoại lai dẫn đến kết quả xét nghiệm sai.

- Xử trí: Tiến hành nhân bản toàn bộ hệ gen mẫu phôi trong phòng áp lực dương, thao tác tiến hành cẩn thận. Phản ứng khuếch đại đoạn gen đột biến cần chạy kèm cả mẫu đối chứng âm để kiểm soát ngoại nhiễm. Sinh thiết lại phôi nếu không khắc phục được.

5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật

- Sai sót: Phân tích kết quả sai, trả nhầm kết quả.

- Xử trí: Cần cẩn trọng phân tích trong các trường hợp, kiểm tra lại kỹ thông tin người bệnh và mã mẫu trên phiếu và trên phần mềm phân tích (Double check).

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Yêu cầu nội kiểm: mỗi kết quả được phân tích và kết luận bởi 2 người có trình độ chuyên môn độc lập. Khi kết quả trùng khớp mới đưa ra kết luận. Nếu kết quả không trùng khớp, kết quả cần được phân tích độc lập bởi một người thứ ba.

- Yêu cầu ngoại kiểm: đối chiếu với kết quả xét nghiệm gen trước đó phát hiện đột biến gây bệnh, so sánh kiểu gen của các thành viên trong gia đình, các mẫu phôi đã có kết quả. (Yêu cầu ngoại kiểm không bắt buộc)

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Raza, Khalid, and Sabahuddin Ahmad. "Principle, analysis, application and challenges of next-generation sequencing: a review." arXiv preprint arXiv:1606.05254 (2016).

2. Single Cell Kit protocol. Qiagen.

3. Pre-implantation Chromosome Aneuploidy Detection Kit (user’s guide). Capitalbio genomics.

PHỤ LỤC 1

QUY TRÌNH KHUYẾCH ĐẠI TOÀN BỘ HỆ GEN BẰNG SINGLE CELL KIT (QIAGEN)

1. Trộn hỗn hợp: Proteinase K solution (2 µL) + Single-cell lysis and fragmentation buffer (32 µL)

2. Lấy 1 µL hỗn hợp được trộn bước 1 + 9,0 µL dung dịch đã chứa tế bào phôi.

3. Ủ 50ºC trong 1 giờ; 99ºC trong 4 phút, sau đó ngay lập tức chuyển ống chứa sản phẩm trên lên khay đá.

4. Thêm 3 µL hỗn hợp dung dịch (tỷ lệ 2 Single-cell library preparation buffer:1 Library stabilization buffer).

5. Ủ hỗn hợp trên 95°C trong 2 phút, ngay lập tức chuyển sang khay đá và ly tâm mẫu.

6. Thêm 1 µL Library preparation enzyme mixture; Sau đó cho chạy Pre PCR (16°C trong 20 phút; at 24ºC trong 20 phút; at 37ºC trong 20 phút; at 75ºC for 5 phút; duy trì ở 4ºC. Hỗn hợp sản phẩm này có thể để được 3 ngày, lưu ở -20 °C.

7. Thêm 61 µL (7,5µL Amplification premix + nước 48,5 µL + 5 µL WGA DNA polymerase). Sau đó chạy PCR (95ºC trong 3 phút; 25 chu kỳ (94ºC trong 30 giây; 65ºC trong 5 phút); duy trì 4ºC).

8. Tinh sạch sản phẩm WGA bằng hạt từ.

9. Mẫu DNA thu được sau khuyếch đại được tiến hành đo nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch. Mẫu DNA được pha loãng về nồng độ từ 10-20 ng/µL để thực hiện phản ứng tiếp theo.

6. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ TRƯỚC CHUYỂN PHÔI/TRƯỚC LÀM TỔ (PGT-A) BẰNG KỸ THUẬT BOBS

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Kỹ thuật xét nghiệm nhiễm sắc thể trước làm tổ bằng kỹ thuật BoBs nhằm sàng lọc các phôi có bất thường lệch bội nhiễm sắc thể trong thụ tinh trong ống nghiệm.

1.2. Định nghĩa

Xét nghiệm nhiễm sắc thể trước làm tổ (PGT-A) là xét nghiệm sàng lọc các bất thường lệch bội nhiễm sắc thể được thực hiện ở giai đoạn đầu của phôi trong quá trình thụ tinh trong ống nghiệm, trước khi phôi bám vào nội mạc tử cung để làm tổ. Xét nghiệm được thực hiện trên một vài tế bào phôi ngày 3-5, nhân bản DNA phôi bào. Sử dụng công nghệ BACs - on - Beads, các hạt BoBs được gắn các đầu dò DNA bao phủ các vùng gen được quan tâm (Karyolite BoBs: toàn bộ 24 nhiễm sắc thể), lai với DNA của phôi bào và DNA mẫu chứng. Tỉ lệ cường độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu phôi so với mẫu chứng cho phép phát hiện được lệch bội tương ứng với mỗi loại nhiễm sắc thể.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 02 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 02 người.

2.2. Vật tư, hoá chất:

2.2.1. Vật tư

- Đầu tip (từ 10 - 1000 µL), đầu tip có lọc (10-200 µL).

- Đồng hồ bấm giờ.

- Đĩa tinh sạch sản phẩm PCR.

- Đĩa PCR 96 giếng.

- Đĩa lọc 0,45 µm.

- Ống thu mẫu 250 µL.

- Ống 1,5 L chống bám dính.

- Miếng nhựa dán phủ 96 giếng, khăn giấy, giấy bạc.

- Hệ thống điện di DNA.

- Giá PCR sạch.

- Khay đá lạnh cho ống 2 mL, 0,25 mL.

- Găng tay tiệt trùng.

2.2.2. Hoá chất

- Bộ kit KaryoLite BoBs (96 test) gồm 2 hộp: P1 và P2, P1 bảo quản nhiệt độ (-30ºC đến -16ºC) và P2 ở nhiệt độ (2- 8ºC).

- Kít nhân bản tế bào đơn SurePlex DNA Amplification System: Cell Extraction Buffer, Extraction Enzyme Dilution Buffer, Cell Extraction Enzyme, Pre-Amp Buffer, Pre-Amp Enzyme, Amplification Buffer, Amplification Enzyme.

- Hóa chất máy Luminex: xMAP Sheath Fluid, xMAP Calibration, xMAP Verification.

- Nước khử ion.

- DNA chứng

- Dung môi Tris-HCl 5mM, pH 8.

- Ethanol 70%.

- Dung môi TE (10mM Tris, pH 8,0, 1mM EDTA).

2.3. Trang thiết bị

- Luminex 100/200.

- Máy lắc ủ TriNEST.

- Máy quang phổ NanoDrop 2000.

- Hệ thống bơm chân không Millipore MultiScreen cùng MultiScreen Vacuum.

- Manifold.

- Máy PCR.

- Máy vortex, máy spin.

- Máy ly tâm lạnh.

- Pipet đơn kênh đa kênh (dải 1-10 µL và 10 - 100 µL).

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Tế bào (phôi 3-5 ngày) được thu vào ống PCR cùng với một lượng tối thiểu dung dịch PBS 1X sao cho thể tích sau khi chuyển chỉ là 2,5 μl.

Mẫu được lấy theo Quy trình hướng dẫn lấy mẫu

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu xét nghiệm: Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên, tuổi, gường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán...

- Kiểm tra lại các thủ tục hành chính theo quy định.

- Kiểm tra lại chỉ định/chống chỉ định (nếu có).

- Kiểm tra lại các xét nghiệm cần thiết.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật (ước tính, đơn vị là giờ): 120h

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử.

3. AN TOÀN

- Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo quy trình an toàn sinh học.

- Dùng trong sàng lọc in vitro.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện kỹ thuật

Gồm: Quy trình nhân bản tế bào đơn và Quy trình Karyolite BoBs.

4.1.1 Quy trình nhân bản tế bào đơn

- Bổ sung 2,5 µL Cell Extraction Buffer vào các ống PCR đã chứa 2,5 µL tế bào và các mẫu đối chứng.

- Chuẩn bị mix hỗn hợp Cell Extraction với số lượng phản ứng tương ứng và trộn đều:

- Thêm 5µL hỗn hợp Extraction vào mỗi mẫu, búng đều, spin và đưa vào

máy chạy chu trình PCR Extraction: Thể tích phản ứng: 10µL.

- Chuẩn bị mix hỗn hợp Pre-Amp với số lượng phản ứng tương ứng và trộn đều:

- Thêm 5µL hỗn hợp Pre-Amp vào mỗi mẫu, búng đều, spin và đưa vào máy chạy chu trình PCR Pre-Amp. Thể tích phản ứng: 15µL.

- Ly tâm nhanh các mẫu và đưa các ống mẫu để trữ trên đá

- Chuẩn bị mix hỗn hợp Amplification:

- Thêm 60 µL hỗn hợp Amplification vào mỗi mẫu, búng đều, spin và

đưa vào máy chạy chu trình PCR Amplification như sau:

- Thể tích phản ứng: 75 µL

- Kiểm tra chất lượng DNA bằng Qubit: Tiến hành đo nồng độ DNA sau nhân bản trên máy Qubit: mẫu chứng âm <2 ng/µL, mẫu nhân bản có nồng độ ≥ 15 ng/µL.

4.1.2. Quy trình Karyolite BoBs

Bước 1: Ghi nhãn DNA (Labeling of Genomic DNA)

- Chuẩn bị 2 phản ứng cho DNA chứng nam và nữ, và 1 phản ứng cho mẫu DNA đã nhân bản. Chuyển 50 ng (khoảng 2 µL) mỗi DNA mẫu vào ống tương đương. Thêm Sample Diluent để đưa thể tích từng ống tới 24 µL.

- Thêm 20 µL Random Primer Solution vào từng ống mẫu. Vortex các ống kỹ và spin down.

- Đóng chặt các nắp ống và đưa các ông vào máy PCR. Biến tính tại 98ºC trong 5 phút, và hạ nhiệt tới 37ºC. Thực hiện bước tiếp theo ngay khi máy PCR đạt 37ºC.

- Chuẩn bị dung dịch ghi nhãn (Labeling Mix) trong ống 1,5 mL. Vortex Biotin - dNTP Mix (ngoại trừ polymerase - có thể dùng tay búng nhẹ vài lần vào ống) và spin down cả hai ống. Thể tích được tính toán thừa để bù trừ cho lỗi pipet. Hút lên xuống Labeling Mix 5-10 lần dùng pipet và spin down trước khi sử dụng:

- Hút 6 µL của Labeling Mix vào từng ống mẫu. Dùng pipet và trộn dung dịch trong ống ít nhất 5 lần và spin down.

- Đóng chặt các nắp ống và ủ các ống mẫu trong máy PCR tại 37°C trong vòng 60 - 90 phút. Đưa các hóa chất đã sử dụng xong trở về đúng điều kiện bảo quản sau bước này.

- Trong lúc chờ đợi phản ứng PCR kết thúc, chuẩn bị cho bước tiếp theo (tinh sạch sản phẩm DNA ghi nhãn). Khi chương trình PCR kết thúc, đưa các ống mẫu khỏi máy PCR.

Ghi chú: Nếu như bước tinh sạch chưa thể thực hiện ngay, bảo quản sản phẩm trong vài tiếng tại 4°C hoặc qua đêm tại -20°C

Bước 2: Tinh sạch sản phẩm DNA ghi nhãn (Purification of labeled DNA Sử dụng đĩa tinh sạch NucleoFast 96 PCR.

Chuyển 50 µL từ mỗi ống mẫu sang giếng tương ứng trên đĩa tinh sạch NucleoFast 96 PCR sử dụng pipet thường hoặc đa kênh.

Ghi chú: Chuyển mẫu thật chậm rãi trực tiếp lên màng (không chọc màng); tránh nhỏ mẫu vào thành giếng.

- Đặt đĩa tinh sạch lên bộ hút chân không. Áp dụng mức chân không khoảng 190 mmHg cho tới khi chất lỏng được hút hết hoàn toàn (khoảng 10 phút). Tắt máy hút chân không.

- Thêm 50 µL dung môi TE (TE buffer) vào từng giếng. Áp dụng mức chân không khoảng 190 mmHg cho tới khi chất lỏng được hút hết hoàn toàn (khoảng 10 phút). Tắt máy hút chân không.

- Thấm khô đáy các giếng của đĩa tinh sạch sử dụng giấy thấm.

- Thêm 25 µL dung môi TE vào từng giếng trên đĩa.

- Đưa đĩa vào máy lắc ủ TriNEST và lắc tại nhiệt độ phòng, 1200 rpm trong 10 phút.

- Chuyển 20 µL của từng mẫu DNA vào ống PCR mới.

- Đo nồng độ DNA tinh sạch.

- DNA gắn nhãn sau khi tinh sạch có thể được bảo quản qua đêm tại 2 - 8 °C trước khi có biểu hiện ảnh hưởng xấu đến kết quả. Votex và ly tâm mẫu trước khi sử dụng.

Bước 3: Lai DNA (DNA Hybridization)

- Đưa Hybridization Buffer ra khỏi tủ âm sâu và BACs-on-Beads Mix từ tủ lạnh.

- Cài máy lắc ủ TriNEST tới 52°C.

- Pha loãng các mẫu DNA gắn nhãn đã được tinh sạch có nồng độ >200 ng/µL về nồng độ 200 ng/µL. Các mẫu có nồng độ từ 150-200 ng/µL không cần tiến hành pha loãng. Dung dịch pha loãng sử dụng là dung môi TE 1X.

- Tạo sơ đồ mẫu cho đĩa thực hiện bước ủ để các mẫu được đánh dấu với từng giếng.

- Sử dụng bảng sau để chuẩn bị Hybridization Mix cho bước lai ủ. Thể tích thừa đã được tính toán:

- Đảm bảo Hybridization Buffer đã đạt nhiệt độ phòng. Vortex rất kỹ 3 lần, mỗi lần 10 giây và spin down.

- Hút lượng Hybridization Buffer cần thiết vào ống đủ cho tổng thể tích của Hybridization Bead Mix.

Ghi chú: Khi pipet Hybridization Buffer, lưu ý thao tác thật chậm vì độ nhớt của dung dịch này rất cao.

- Vortex Karyolite BoBs Mix rất kỹ 3 lần, mỗi lần 10 giây ngay trước khi dùng và pipet lượng thể tích cần thiết vào ống Hybridization Bead Mix

- Ly tâm rất nhanh Hybridization Bead Mix và vortex rất kỹ 3 lần, mỗi lần 10 giây.

- Chuyển 11 µL của Hybridization Bead Mix vào từng giếng đã được dựng trong sơ đồ.

Ghi chú: Thao tác pipet rất chậm vì dung dịch có độ nhớt cao.

- Chuyển 5 µL của DNA mẫu đã được tinh sạch vào đáy mỗi giếng có chứa Hybridization Bead Mix (sử dụng pipet thường hoặc đa kênh).

- Đậy nắp của đĩa PCR. Đảm bảo các nắp đã được đóng thật chặt.

- Chuyển đĩa mẫu ủ vào máy TriNEST tại 52°C và lắc tại 800 rpm trong 5 phút.

- Đặt đĩa vào máy PCR và biến tính ở 85°C trong 5 phút, và hạ nhiệt xuống tới 52°C.

- Khi máy PCR đã đạt 52 °C, đưa đĩa khỏi máy PCR và một lần nữa đảm bảo các nắp trên đĩa đã được đóng thật chặt.

- Để đĩa rất nhanh vào máy lắc ủ tại 52°C và lắc tại 800 rpm trong vòng 16 - 20 tiếng.

- Đặt tấm làm mát vào tủ lạnh +2 - +8°C chuẩn bị cho bước hạ nhiệt máy lắc ủ trong bước 4.

Bước 4: Rửa DNA và gắn phân tử báo cáo

- Bật máy Luminex 100/200 để laser và hệ thống được khởi động ít nhất trước 30 phút trước khi sử dụng.

- Lấy Wash Buffer 1 từ tủ lạnh, tính toán lượng Wash Buffer 1 cần sử dụng. 125 µL là cần cho mỗi giếng (thể tich thừa để bù trừ khi sử dụng pipet đa kênh đã được kết hợp).

- Lấy đĩa ủ lai từ máy lắc ủ (52°C) và ngay lập tức cài chế độ 50°C cho máy lắc ủ.

- Tháo các nắp giếng cẩn thận và nhẹ nhàng. Thêm 100µL của Wash Buffer 1 vào từng giếng (dùng pipet đơn hoặc đa kênh). Hút lên xuống 10 lần nhanh liên tục để trộn dung dịch.

- Ủ đĩa tại 50°C và 1200 rpm trong 20 phút.

- Chuẩn bị dụng cụ để hạ máy lắc ủ xuống 37°C.

- Trong lúc chờ đợi, lấy Reporter Concentrate, Reporter Diluent, và Wash Buffer 2 từ tủ lạnh và chuẩn bị Reporter Mix.

- Sử dụng bảng sau để tính toán lượng hóa chất cần thiết:

- Hút lượng thể tích cần thiết của Reporter Diluent vào ống thích hợp.

- Vortex Reporter Concentrate trong 5 giây, spin down và pipet lượng cần thiết vào ống Reporter Mix. Ngay lập tức, gói ống Reporter Mix vào giấy bạc để tránh ánh sáng.

- Vortex Reporter Mix 5 giây.

- Đĩa lọc 0,45 µm được sử dụng cho việc rửa và gắn phân tử Reporter. Tạo sơ đồ mẫu trên đĩa lọc.

- Đậy lại các giếng chưa sử dụng trên đĩa lọc với miếng dãn đĩa bằng nhựa trong.

- Tính toán thể tích Wash Buffer 2 cần thiết. 0,47 mL cần cho mỗi giếng (thể tich thừa để bù trừ khi sử dụng pipet đa kênh đã được kết hợp).

- Thêm 30 µL của Wash Buffer 2 vào các giếng sẽ sử dụng trên đĩa lọc để tao ẩm cho các giếng này. Không chạm màng của đĩa lọc.

- Lấy đĩa ủ lai ra khỏi máy lắc ủ (50°C). Ngay lập tức, cài đặt máy vào chế độ lắc tại 37°C. Đưa tấm làm mát vào máy lắc ủ, tháo các giá đỡ đĩa để hạ nhiệt máy xuống 37°C. Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch trong các giếng của đĩa ủ lai sang đĩa lọc đã được tạo ẩm.

- Sử dụng hệ hút chân không tại áp suất 125 mmHg, Hút toàn bộ dung dịch trong giếng và dừng lại ngay khi hết dung dịch.

- Thêm 100 µL của Wash Buffer 2 vào từng giếng. Không chạm màng lọc và lặp lại bước loại dịch.

- Cho thêm 100 µL của Wash Buffer 2 vào từng giếng. Không chạm màng lọc và lặp lại bước loại dịch.

- Lau khô đáy đĩa lọc bằng giấy thấm.

- Thêm 100 µL của Reporter Mix vào từng giấy của đĩa lọc. Không chạm màng lọc.

Ghi chú: Đảm bảo máy lắc ủ đã đạt 37°C tại thời điểm này. Không đợi quá 15 phút giữ đĩa lọc tại nhiệt độ phòng và bảo về khỏi ánh sáng.

- Ủ đĩa lọc trong máy lắc ủ tại 37°C, tốc độ lắc 1200 rpm trong 30 phút

- Sau bước ủ với Reporter Mix, sử dụng bộ hút chân không để loại bỏ dung dịch trên đĩa.

- Cho thêm 100 µL của Wash Buffer 2 vào từng giếng.

- Lau khô đáy đĩa lọc bằng giấy thấm.

- Cho thêm 100 µL của Wash Buffer 2 vào từng giếng. Không chạm màng lọc.

Ghi chú: Không hút chân không sau bước này. Đĩa lọc được chuyển và đọc với hệ thống Luminex 100/200. Nếu như bước đo không được thực hiện ngay trong vòng 15 phút, gói đĩa trong giấy bạc để bảo vệ khỏi ánh sáng.

Bước 5: Đọc tín hiệu xét nghiệm

- Đảm bảo bước khởi động máy của Luminex đã được thực hiện. Hệ thống đã được thực hiện hiệu chuẩn và xác minh (calibration/verification) và đầu kim đã được điều chỉnh độ cao cho đĩa lọc.

- Mở protocol xét nghiệm.

- Đặt tên file xuất dữ liệu (.cvs - được đọc trên BoBsoft).

- Điền tên vào sơ đồ đĩa (F, M và mẫu …).

Ghi chú: Mẫu DNA chứng nam phải luôn được đặt tên là M và F là của DNA chứng nữ theo đúng yêu cầu từ phần mềm phân tích BoBsoft.

- Đưa đĩa lọc vào máy, làm theo hướng dẫn và bắt đầu đọc tín hiệu.

- Sau khi đọc, các giếng chưa sử dụng vẫn có thể được sử dụng cho xét nghiệm tiếp theo.

- Đổ bỏ các dung môi Wash còn dư trong máng.

4.2. Nhận định kết quả

Kết quả thu được từ hệ thống máy Luminex 100/200 sẽ được phân tích bằng phần mềm BoBsoft. Cường độ tín hiệu huỳnh quang trung bình của mẫu DNA sau khi lai với đầu dò BAC đặc trưng được so sánh với cường độ tín hiệu huỳnh quang trung bình của mẫu DNA chứng liên kết với cùng đầu dò đặc trưng. Tỉ lệ của mẫu so với chứng nam và mẫu so với chứng nữ được tính toán với mỗi đầu dò BAC. Đối với thêm hoặc mất trong cánh nhiễm sắc thể, tất cả các đầu dò trong vùng phải có xu hướng dịch chuyển cùng 1 phía và lệch so với tỷ lệ bình thường 1.0.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét nghiệm.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

- Sai sót: Tế bào sinh thiết phôi nếu chưa sử dụng ngay, có thể được bảo quản -80ºC từ 3-5 ngày để đảm bảo độ ổn định chất lượng mẫu.

- Xử trí: Lấy lại mẫu (nếu cần thiết khi các chỉ số phân tích không đạt).

5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật

- Sai sót: Mọi sai lệch khi thực hiện quy trình đều gây ảnh hưởng đến kết quả.

- Xử trí: Cần đảm bảo chính xác ở mỗi bước và toàn bộ quy trình.

5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dupont C, Grati FR, Choy KW, et al. Prenatal diagnosis of 24 cases of microduplication 22q11. 2: an investigation of phenotype-genotype correlations. Prenatal Diagnosis. 2015;35(1):35-43.

2. Hassold T, Hunt P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2001;2(4):280-291.

3. Portnoï M-F. Microduplication 22q11. 2: a new chromosomal syndrome. European journal of medical genetics. 2009;52(2-3):88-93.

7. KHÁM VÀ TƯ VẤN BỆNH DI TRUYỀN

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Quy trình khám và tư vấn bệnh di truyền nhằm quy định và hướng dẫn công tác khám bệnh, xét nghiệm và tư vấn cho người bệnh/khách hàng tại các chuyên khoa Di truyền lâm sàng; góp phần nâng cao chất lượng khám, chữa bệnh tại Bệnh viện.

1.2. Định nghĩa

Bệnh di truyền bao gồm các bệnh liên quan đến sự bất thường trong vật liệu di truyền từ cấp độ tế bào đến cấp độ phân tử, và các bệnh bẩm sinh bất thường có thể biểu hiện từ khi sinh ra hoặc sau này do nguyên nhân di truyền. Những bệnh này ảnh hưởng đến nhiều chuyên ngành lớn như Nhi khoa, Sản phụ khoa, Tim mạch, Huyết học, Tiêu hóa, Thần kinh, Nội tiết, Nam khoa và Ung thư.

Khám và tư vấn bệnh di truyền là một quá trình trong đó các bác sĩ thu thập bệnh sử, thăm khám lâm sàng, thực hiện các xét nghiệm cần thiết và đưa ra chẩn đoán, hướng dẫn hoặc điều trị đối với các bệnh lý di truyền. Tư vấn di truyền bao gồm giải pháp thích hợp và hướng dẫn về các vấn đề y tế, diễn biến bệnh, nguy cơ di truyền và các lựa chọn để giảm nguy cơ tái bệnh bệnh. Quá trình này tôn trọng quyền tự quyết định của người được tư vấn và hỗ trợ đưa ra các quyết định có hiểu biết về sức khỏe và sinh sản của mình, phù hợp với giá trị và tín hiệu cá nhân. Nhà tư vấn dịch vụ truyền thông không đưa ra quyết định cuối cùng về tôn trọng sự lựa chọn của người được tư vấn.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Khám và tư vấn bệnh di truyền: Bác sĩ: 01.

- Tư vấn di truyền: Bác sĩ hoặc tương đương: 01.

- Điều dưỡng/kỹ thuật y: 01.

2.2. Vật tư:

- Dụng cụ khám bệnh: ống nghe, máy đo huyết áp, thước dây đo vòng đầu, búa phản xạ, tràng hạt, cân đo chiều cao cân nặng, đồng hồ bấm thời gian.

- Khẩu trang tiệt trùng.

- Găng tay tiệt trùng không bột.

- Cồn sát khuẩn.

- Nước muối sinh lý.

- Betadine.

- Phiếu chỉ định xét nghiệm.

- Phiếu khám và tư vấn bệnh di truyền.

- Phiếu đồng thuận thực hiện xét nghiệm.

2.3. Trang thiết bị

Bộ máy tính có phần mềm bệnh án di truyền điện tử / bệnh án di truyền giấy.

2.4. Chuẩn bị người bệnh

- Người bệnh có nhu cầu khám và tư vấn bệnh di truyền hoặc được chỉ định khám bệnh di truyền đăng ký khám và tư vấn bệnh di truyền tại quầy đón tiếp chung của bệnh viện hoặc quầy đón tiếp của Các chuyên khoa Di truyền lâm sàng. Sau khi đăng ký thành công, mỗi người bệnh sẽ có phiếu khám bệnh. Tư vấn di truyền.

- Người bệnh được hướng dẫn vào phòng khám bệnh và tư vấn di truyền.

- Người bệnh khám và tư vấn di truyền lần đầu sẽ được khám, tư vấn, xét nghiệm di truyền, xét nghiệm chuyên khoa liên quan đến bệnh, có kết quả xét nghiệm sẽ được tái khám và tư vấn di truyền.

- Người bệnh khám và tư vấn di truyền khi đã có kết quả xét nghiệm di truyền, cần chuẩn bị đủ hồ sơ khám chữa bệnh lần đầu hoặc từ các chuyên khoa (nếu có).

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu xét nghiệm: Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên, tuổi, gường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán...

- Kiểm tra lại các thủ tục hành chính theo quy định.

- Kiểm tra lại chỉ định/chống chỉ định (nếu có).

- Kiểm tra họ tên, tuổi, thông tin thai phụ.

- Kiểm tra lại các xét nghiệm cần thiết.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật (ước tính, đơn vị là giờ):

Thời gian thực hiện tùy theo bệnh tật, có thể dao động từ 10 phút đến 30 phút.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng khám và tư vấn di truyền

3. AN TOÀN

Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi khám bệnh và thực hiện tư vấn di truyền. Phòng khám đảm bảo an toàn theo quy định về phòng chống cháy nổ chung, có đủ ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm phù hợp, đảm bảo về tiếng ồn không ảnh hưởng tới quá trình khám và tư vấn di truyền, phòng tư vấn cần độc lập với các phòng khác, mang tính chất riêng tư. Trong phòng có bảng chỉ dẫn và quy trình khám, tư vấn di truyền.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện kỹ thuật

Bước 1. Mở hồ sơ bệnh án di truyền điện tử/ bệnh án giấy

Bước 2. Hỏi bệnh sử

- Hỏi thời điểm phát hiện thấy bất thường, diễn biến, trình tự xuất hiện và biến đổi về mức độ các biểu hiện bất thường đó.

- Hỏi kỹ những lần khám trước. Các xét nghiệm, thăm dò lâm sàng và cận lâm sàng liên quan đến vấn đề bất thường di truyền cũng như các bệnh toàn thân khác.

Các bệnh tật di truyền là bẩm sinh hoặc mới phát sinh, đối tượng khám có thể trả lời, hoặc cần phải khai thác bệnh sử từ người giám hộ của người bệnh, bệnh có tính chất gia đình cần khai thác cả triệu chứng của những người có biểu hiện bệnh tương tự người bệnh.

Bước 3. Hỏi tiền sử

- Hỏi tiền sử bệnh tật của bản thân thai phụ: các bệnh nội khoa, ngoại khoa, sản phụ khoa.

- Hỏi tiền sử gia đình, dòng họ về các bệnh di truyền, các dị tật bẩm sinh.

Bước 4. Xây dựng phả hệ

Thực hiện xây dựng phả hệ ít nhất ba thế hệ, chú thích rõ đối tượng thăm khám và tư vấn di truyền.

Bước 5. Khám bệnh

- Khám toàn thân/ bộ phận

+ Đo chiều cao, cân nặng.

+ Khám da, niêm mạc xem có thiếu máu hay phù không.

+ Đo huyết áp: tư thế nằm hoặc ngồi.

+ Khám tim phổi.

+ Khám nam khoa, sản phụ khoa và các đặc tính sinh dục phụ (nếu cần gửi chuyên khoa khám).

+ Khám các bộ phận khác, nếu bất thường chuyển khám chuyên khoa.

- Khám bệnh di truyền

+ Đánh giá tâm lý, tâm thần người bệnh (thông qua hỏi bệnh và các test trí tuệ), có thể gửi khám chuyên khoa tâm thần nếu cần.

+ Quan sát hình thái khuôn mặt và các bộ phận trên khuôn mặt, các hội chứng bệnh tật di truyền thường có dị hình khuôn mặt (dysmorphic), có thể nhận hỗ trợ từ ứng dụng phần mềm trí tuệ nhân tạo để nhận diện (FACE2GENE).

+ Quan sát và khám từ toàn thân đến các bộ phân cơ thể, định hướng từ các bệnh/ hội chứng di truyền (gợi ý từ khuôn mặt dị hình, toàn thân, bộ phận bất thường).

+ Đối với các bệnh có tính gia đình, cần yêu cầu khám cho người có biểu hiện triệu chứng hoặc chưa rõ liên quan đến người bệnh (trong cùng phả hệ được xây dựng).

- Chẩn đoán sơ bộ bệnh/ hội chứng di truyền.

Bước 6. Tư vấn trước xét nghiệm (nếu người bệnh chưa có xét nghiệm di truyền hoặc các xét nghiệm chẩn đoán)

- Tư vấn các xét nghiệm di truyền.

- Tư vấn các xét nghiệm chuyên khoa.

- Tư vấn các xét nghiệm di truyền phù hợp với người bệnh, tư vấn trước xét nghiệm để người bệnh đồng thuận thực hiện xét nghiệm, phục vụ cho chẩn đoán và tiên lượng bệnh.

- Người bệnh kí phiếu đồng thuận xét nghiệm di truyền.

Bước 7. Chỉ định xét nghiệm (nếu có)

Bước 8. Chẩn đoán bệnh, tật, hội chứng di truyền

- Dựa vào các thăm khám lâm sàng và cận lâm sàng.

- Hội chẩn di truyền, Hội chẩn liên chuyên khoa (nếu cần).

Bước 9. Tư vấn di truyền sau xét nghiệm

- Xác định bệnh, tật, hội chứng của người bị mắc là gì?.

- Bệnh, tật có di truyền không? Nếu có di truyền thì theo cơ chế, quy luật nào?

- Tiên lượng bệnh, tật, các rủi ro của bệnh tật. Xác định khả năng điều trị và phòng bệnh, hướng nghiệp cho người bệnh nếu cần thiết.

- Xác định xác suất sinh con bình thường, con bị bệnh, con mang gen bệnh, giúp cho người được tư vấn hiểu về những rủi ro, nguy cơ tái mắc bệnh nếu sinh con, từ đó, đưa ra những quyết định phù hợp với bản thân họ, với gia đình và xã hội.

- Cần kết hợp tâm lý y học và luật pháp để bảo vệ hạnh phúc cho người bệnh. Tạo sự tin tưởng, yên tâm của người được tư vấn, hiểu rõ về bệnh tật và có sự ứng xử phù hợp với bệnh tật di truyền.

Bước 10. Chỉ định thuốc và các phương pháp điều trị phù hợp (nếu có)

Bước 11. Tổng kết quá trình tư vấn di truyền, hẹn khám lại

- Việc hẹn khám lại tùy tình trạng và mức độ bệnh.

- Tổng kết nội dung tư vấn di truyền cho người bệnh/ gia đình người bệnh- Theo dõi và đánh giá kết quả tư vấn di truyền để tầm soát bệnh tật, hội chứng di truyền.

Bước 12. Ghi và hoàn thiện hồ sơ bệnh án.

4.2. Nhận định kết quả

Tùy từng trường hợp với những kết quả xét nghiệm đã có và được chỉ định thêm mà đưa ra chẩn đoán xác định, tư vấn và phương hướng điều trị, dự phòng cho người bệnh.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét nghiệm.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện khám và tư vấn di truyền

- Sai sót: Không đúng người bệnh

- Xử trí: Đảm bảo đúng người bệnh, bác sĩ đúng chuyên ngành

5.2. Trong quá trình khám và tư vấn di truyền

- Sai sót: không đủ thông tin của người bệnh

- Xử trí:

+ Khai thác đầy đủ tiền sử, bệnh sử, tránh bỏ sót.

+ Vẽ và xây dựng phả hệ đúng, đầy đủ dựa trên thông tin khai thác từ người bệnh và các xét nghiệm đã có.

+ Chỉ định đúng xét nghiệm để phục vụ cho chẩn đoán

5.3. Sau khi thực hiện khám và tư vấn di truyền

- Sai sót: không theo dõi và tầm soát bệnh

- Xử trí:

+ Cần đưa ra hướng xử lý kịp thời, biện pháp xử trí và điều trị thích hợp.

+ Tư vấn đưa ra những thông tin biện pháp để phòng và chữa bệnh một cách hiệu quả nhất cho tương lai người bệnh và người nhà của họ.

+ Theo dõi và đánh giá kết quả.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

Dựa trên các kết quả xét nghiệm và hồ sơ bệnh án di truyền đưa ra chẩn đoán, điều trị và tư vấn cho người bệnh.

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Quyết định số 573/QĐ-BYT ngày 11/02/2010 của Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành quy trình sàng lọc, chẩn đoán trước sinh và sơ sinh.

2. Thông tư số 01/2013/TT-BYT ngày 11/01/2013 của Bộ Y tế hướng dẫn thực hiện quản lý chất lượng xét nghiệm tại cơ sở khám bệnh, chữa bệnh.

3. Thông tư số 34/2017/TT-BYT ngày 18/8/2017 của Bộ Y tế hướng dẫn tư vấn, sàng lọc, chẩn đoán, điều trị trước sinh và sơ sinh.

4. Thông tư số 49/2018/TT-BYT ngày 28/12/2018 của Bộ Y tế hướng dẫn hoạt động xét nghiệm trong khám bệnh, chữa bệnh.

5. Quyết định số 941/QĐ-BVĐHYHN ngày 28/12/2018 của Giám đốc Bệnh viện Đại học Y Hà Nội về việc ban hành Quy chế công tác các khoa, trung tâm, đơn vị thuộc Bệnh viện Đại học Y Hà Nội.

6. Quyết định số 955/QĐ-BVĐHYHN ngày 28/12/2018 của Giám đốc Bệnh viện Đại học Y Hà Nội về việc ban hành Quy chế công tác chuyên môn tại Bệnh viện Đại học Y Hà Nội.

7. Trần Đức Phấn, Lương Thị Lan Anh, Trường Đại học Y Hà Nội (2022), Di truyền Y học, Di truyền lâm sàng và Tư vấn Di truyền, NXB Y học.

8. Lương Thị Lan Anh, Phạm Cẩm Phương, Trường Đại học Y Hà Nội (2023), Nguyên lý di truyền ung thư, NXB Y học.

9. Lương Thị Lan Anh, Phạm Cẩm Phương, Trường Đại học Y Hà Nội (2024), Di truyền ung thư lâm sàng, NXB Y học.

10. Trương Thanh Hương, Đỗ Doãn Lợi, Trường Đại học Y Hà Nội (2020), Di truyền trong tim mạch lâm sàng, NXB Y học.

11. Bộ môn Y sinh học - Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội (2021), Thực hành Di truyền Y học, NXB Y học.

12. Vivian Y. Pan (Editor), Jane L.Schuette (Editor), Karen E. Wain (Editor), Beverly M. Yashar (Editor). A guide to genetic counseling, 3rd Edition, SBN: 978-1-119-89208-3, November 2024, Wiley- Blackwell

13. Thompson & Thompson (2024). Genetics and Genomics in Medicine. Ninth Edition. Elsevier.

14. Lynn B. (2020). Medical genetics. Sixth Edition. Elsevier.

15. Antonie D. (2024). Genomics in Clinic. A Practical Guide to Genetic Testing, Evaluation, and Couseling. Elsevier.

8. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ BẰNG KỸ THUẬT DNA MICROARRAY

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Xét nghiệm nhiễm sắc thể bằng kỹ thuật microarray (SNParray, aCGH...) là một xét nghiệm được sử dụng để phát hiện sự mất cân bằng nhiễm sắc thể, các biến thể số lượng bản sao kích thước nhỏ (vi lặp đoạn/ vi mất đoạn) trong toàn bộ hệ gen.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Xét nghiệm nhiễm sắc thể bằng kỹ thuật microarray sử dụng các đoạn dò DNA ngắn (probe) đặc hiệu cho các vùng gen (locus) cần khảo sát nằm trên 23 cặp nhiễm sắc thể (NST), được sắp xếp một cách chính xác trên lam kính thành một hệ thống lưới được gọi là con chip. Tiến hành lai DNA huỳnh quang rồi so sánh cường độ tín hiệu của mẫu xét nghiệm với mẫu chứng. Kỹ thuật này có thể phát hiện những thay đổi có kích thước từ 100 Kb (tùy thuộc độ phân giải của từng kit) - độ phân giải này cao hơn tới 1000 lần so với độ phân giải của nhiễm sắc thể đồ thông thường, do đó cho phép phát hiện các vùng nhỏ mà kỹ thuật karyotype không thể phát hiện được.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 02 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 02 người.

2.2. Vật tư

- Hộp đựng slide tránh ozone.

- Ống thu mẫu1,5 mL chống bám dính và không nhiễm RNase (bền tại 98°C).

- Pipet đơn kênh dải thể tích 0,1-2,5 µL; 2-20 µL; 20-20 µL; 100-1000 µL.

- Pipet đa kênh dải thể tích 10 - 100 µL; 30 -300 µL.

- Đầu típ chống bám dính (thể tích từ 0,5 - 1000 µL).

- Đồng hồ bấm giờ.

- Đĩa PCR 96 giếng.

- Đĩa PCR 96 giếng và các nắp dải 8 giếng.

- Miếng nhựa dán đĩa vi tấm, miếng film dán đĩa, tấm nhôm dán đĩa.

- Giấy thấm, giấy nhôm.

- Găng tay tiệt trùng không bột.

- Bình trữ tiệt trùng.

- Đĩa thuỷ tinh 1,5 L.

- Khay đựng đá lạnh.

- Nhíp sạch.

- Khay đựng lai rửa (x3 hoặc x5 vị trí slide) và đĩa rửa thể tích 250 mL.

- Bộ kit tách chiết DNA (tuỳ chọn).

- Bộ kit tinh sạch DNA tùy chọn.

- 1×TE (pH 8.0), dùng cho sinh học phân tử (10mM Tris-HCl, 1 mM EDTA•Na2).

- Nước cất DNase/RNase-free.

- Nước siêu sạch Milli-Q.

- Human Genomic DNA.

- Bộ hóa chất lai và chip lai.

2.3. Trang thiết bị

- Hệ thống Microarray Scanner- - Hệ thống lai tương ứng với chip lai.

- Máy ủ slide thiết lập nhiệt độ tại 67°C - Lồng sắt quay cho máy ủ slide

- Khay rửa slide Microarray.

- Ống thành mỏng 200 µL.

- Ngăn lai hoá bằng thép không gỉ (Agilent p/n G2534A).

- Ngăn lai hoá bằng thép không gỉ.

- Đệm dùng cho lai hoá slide - loại đóng gói 8-.

- Máy đo nồng độ DNA.

- Máy khuấy từ gia nhiệt.

- Máy spindown.

- Máy ly tâm lạnh để bàn tốc độ 12000 x g.

- Ống PCR 0,5 mL thành mỏng loại trong.

- Máy luân nhiệt có chế độ làm nóng nắp.

- Máy vortex.

- Máy đo quang phổ UV-VIS.

- Máy cô chân không.

- Bể nước tuần hoàn hoặc block nhiệt. Cho tách chiết DNA, thiết lập tại 56°C, 37°C, 65°C và 98°C.

- Thanh khuấy từ, 7,9 × 38,1 mm (×2 hoặc ×4).

- Tủ hút ẩm hoặc hộp đựng N2 sạch để trữ slide.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

2.4.1. Đối với QTKT lấy mẫu bệnh phẩm

- Loại mẫu: Mẫu máu ngoại vi chống đông EDTA, mẫu tế bào như tế bào dịch ối, mẫu tế bào khác…

- Thể tích mẫu: mẫu máu ngoại vi 2 mL-3 mL, dịch ối 10-15 mL.

- Thời điểm tối ưu để lấy mẫu xét nghiệm: mẫu máu ngoại vi đối với sau sinh, mẫu dịch ối là từ tuần 16 của thai kỳ. Ghi nhận tuổi thai tại thời điểm chọc ối.

- Kiểm tra thông tin:

+ Kiểm tra lại chỉ định/chống chỉ định (nếu có).

+ Kiểm tra họ tên, tuổi, thông tin thai phụ.

+ Kiểm tra lại các xét nghiệm cần thiết.

2.4.2. Đối với QTKT về thực hiện xét nghiệm: chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy định: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật (ước tính, đơn vị là giờ): 96 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử.

3. AN TOÀN

Nêu các vấn đề an toàn cần lưu ý khi thực hiện kỹ thuật (nếu cần thiết), có thể bao gồm:

Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo quy trình về an toàn xét nghiệm, an toàn điện và phòng tránh cháy nổ, an toàn hóa chất: có bảng chỉ dẫn an toàn từng loại hóa chất (có thể xây dựng quy định riêng nếu cần), an toàn sinh học, an toàn môi trường: đánh giá các yếu tố vi khí hậu như nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, tiếng ồn…

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

4.1.1 Bước 1. Chuẩn bị mẫu DNA

a. Tách chiết gDNA

- DNA cần được tách trong vòng 24 tiếng sau khi thu mẫu.

- Lượng DNA ≥ 500 ng được khuyến cáo sử dụng phương pháp trực tiếp (Direct Method, xem mục 3.1.4). Lượng DNA < 500 ng được khuyến cáo sử dụng phương pháp khuếch đại gDNA (xem mục 3.1.3).

- DNA sau khi được tách và tinh sạch có thể được bảo quản trong môi trường Tris-EDTA (pH 7.2) tại 2 - 8 ºC trong 1 năm; tại -20 ºC trong vòng 7 năm; và tại -70 ºC cho ít nhất 7 năm.

b. Định lượng và kiểm tra chất lượng DNA

Tuỳ chọn các phương pháp đo quang phổ UV-VIS hay bằng máy đo Qubit.

c. Khuếch đại (Amplification of gDNA)

Chuyển 50 ng gDNA vào ống 200 µL hoặc giếng, pha loãng với nước Dnase/Rnase-free thể tích 10 µL.

- Thêm 1 µL dung dịch 10x Fragmentation Buffer vào mỗi mẫu. Pipet lên xuống nhẹ để trộn đều.

- Đặt các ống hoặc giếng chứa mẫu vào máy luân nhiệt, cài đặt nhiệt độ nắp nhiệt ở 95 ºC và ủ trong chính xác 4 phút.

Lưu ý: Thời gian ủ phân mảnh gDNA sẽ ảnh hưởng đến chất lượng và kết quả quy trình.

- Chuyển các mẫu sang khay đá lạnh ngay sau khi hết thời gian ủ, sau đó ly tâm nhanh để tập trung phần dung dịch báo trên thành ống xuống đáy. Lưu ý: Phải tiếp tục thực hiện bước 2 để không làm ảnh hưởng đến chất lượng library DNA.

d. Chuẩn bị DNA library

- Thêm 2 µL dung dịch 1x Library Preparation Buffer vào mỗi mẫu.

- Thêm 1 µL dung dịch Library Stabilization Solution vào mỗi mẫu.

- Trộn đều, ly tâm nhanh để tập trung phần dung dịch bám trên thành ống xuống đáy, đặt các ống hoặc giếng chứa mẫu vào máy luân nhiệt, cài đặt nhiệt độ nắp nhiệt ở 95ºC trong 2 phút.

- Chuyển mẫu sang khay đá lạnh, ly tâm nhanh để tập trung dung dịch xuống đáy, chuyển lại về khay đá lạnh.

- Thêm 1 µL dung dịch Library Preparation Enzyme. Trộn đều, ly tâm nhanh để tập trung dung dịch xuống đáy.

- Đặt các ống hoặc giếng chứa mẫu vào máy luân nhiệt và ủ theo điều kiện trong bảng 1 (tổng thời gian ủ hơn 1 tiếng).

Bảng 1. Chu trình ủ nhiệt chuẩn bị DNA library bằng máy luân nhiệt

- Lấy mẫu ra khỏi máy luân nhiệt, ly tâm nhanh để tập trung dung dịch xuống đáy. Tổng thể tích mỗi mẫu lúc này là 15 µL. Có thể tiếp tục thực hiện bước khuếch đại hoặc trữ mẫu ở -20°C trong vòng 3 ngày.

e. PCR

- Chuẩn bị các thành phần cho phản ứng PCR trong

- Bảng 2 trên khay đá lạnh.

Bảng 2. Thành phần phản ứng khuếch đại gDNA

- Thêm 60 µL Amplification Master Mix vào mỗi 15 µL mẫu thu được ở bước trước để đạt tổng thể tích phản ứng PCR là 75 µL.

- Trộn và ly tâm nhanh, đặt ống hoặc giếng chứa phản ứng vào máy luân nhiệt và vận hành chu trình nhiệt với điều kiện trong Bảng 3:

Bảng 3. Chu trình nhiệt phản ứng khuếch đại gDNA

Kết thúc phản ứng PCR, giữ mẫu ở 4 °C hoặc trữ lạnh ở -20 °C trong vòng 3 ngày cho đến khi thực hiện bước tinh sạch.

4.1.2 Bước 2. Tinh sạch

- Sử dụng kit tùy chọn hoặc GenElute PCR Clean-Up.

- Định lượng sản phẩm DNA đã khuếch đại.

- Kiểm tra chất lượng sản phẩm DNA khuếch đại bằng phương pháp đo Nanodrop hoặc phương pháp tương khác tương ứng.

Chuẩn bị trước khi đánh dấu DNA

- Chuyển 2 µg mẫu DNA đã khuếch đại và tinh sạch vào ống 1,5 mL Rnase-free hoặc đĩa PCR, pha loãng với nước DNase/Rnase-free để đạt thể tích 26 µL. Đảm bảo lượng DNA trong mẫu DNA thực và mẫu DNA chứng là như nhau trước khi thực hiện bước phản ứng đánh dấu.

- Nếu thể tích mẫu DNA đã khuếch đại và tinh sạch (2 µg) vượt quá 26 µL, thực hiện bước cô đặc mẫu DNA bằng máy Vacuum concentrator (Speed Vac) và hòa tan mẫu với DNase/Rnase-free water.

4.1.3 Bước 3. Phương pháp trực tiếp (Direct Method)

a) Phản ứng phân đoạn DNA bằng enzyme (Restriction Digestion)

- Cài đặt nhiệt độ các block nhiệt hoặc bể điều nhiệt ở 37°C và 65°C, đảm bảo thiết bị đạt đến nhiệt độ yêu cầu trước khi ủ; hoặc sử dụng máy luân nhiệt để cài đặt các nhiệt độ trên.

- Rã đông 10x Restriction Enzyme Buffer và dung dịch BSA. Búng nhẹ ống để trộn đều và ly tâm nhanh (spindown). Bảo quản trên đá trong suốt quá trình sử dụng và trữ đông -20°C khi không sử dụng.

- Cho mỗi phản ứng, chuyển 500 ng gDNA vào ống DNase/RNase-free, pha loãng với nước DNase/RNase-free để mẫu đạt đến thể tích 20,2 µL.

- Chuẩn bị Digestion Master Mix theo thành phần trong.

- Pipet lên xuống để trộn đều. Giữ các hóa chất trên khay đá lạnh.

Bảng 4. Thành phần Digestion Master Mix

- Thêm 5,8 µL Digestion Master Mix vào mỗi mẫu DNA, pipet lên xuống để trộn đều.

- Ủ mẫu: Chuyển các mẫu vào ủ nhiệt độ 37°C trong 2 tiếng

- Chuyển sang 65°C và ủ trong 20 phút để bất hoạt enzyme.

- Chuyển mẫu sang khay đá lạnh.

- Trường hợp sử dụng máy luân nhiệt, có thể cài đặt chu trình nhiệt như Bảng 5 sau:

Bảng 5. Phản ứng phân đoạn mẫu bằng máy luân nhiệt

Chuyển sang bước đánh dấu DNA (mục 3.2.1), hoặc trữ mẫu đã phân cắt bằng enzyme ở -20°C trong vòng 1 tháng.

4.1.4 Bước 4. Tiến hành

- Đưa các hóa chất ra khỏi tủ âm sâu và để các hóa chất tại nhiệt độ phòng từ 15 - 30 phút trước khi sử dụng. Đảm bảo các hóa chất đã được rã đông trước khi sử dụng:

- Đưa các hóa chất từ tủ lạnh (2 - 8ºC) và để các hóa chất tại nhiệt độ phòng từ 15 - 30 phút trước khi sử dụng:

+ DNA thực;

+ DNA chứng (nữ);

+ DNA chứng (nam).

- Trước khi sử dụng, vortex đều và ly tâm nhanh các mẫu DNA thực, mẫu DNA chứng và các hóa chất sử dụng. Để các hóa chất tại nhiệt độ phòng để đảm bảo độ hòa tan và trộn tối đa.

4.1.4.1 Đánh dấu huỳnh quang lên DNA (Fluorescent Labeling of gDNA)

1. Các mẫu DNA thực sẽ được đánh dấu màu cyanine 5 và mẫu DNA chứng (Human Reference DNA, nam và nữ) sẽ gắn màu cyanine 3.

2. Cài đặt nhiệt độ các block nhiệt hoặc bể điều nhiệt ở 98°C, 37°C và 65°C, đảm bảo thiết bị đạt đến nhiệt độ yêu cầu trước khi ủ; hoặc sử dụng máy luân nhiệt để cài đặt các nhiệt độ trên.

3. Ly tâm nhanh các mẫu (1 phút, 6000 x g) để tập trung phần dung dịch xuống đáy.

4. Thêm 5 µL Random Primer vào mỗi ống hoặc giếng chứa 26 µL mẫu DNA. Pipet lên xuống nhẹ để trộn đều.

5. Chuyển các mẫu vào ủ nhiệt độ 98°C trong 10 phút, sau đó chuyển sang khay đá lạnh và ủ trong 5 phút. Trường hợp sử dụng máy luân nhiệt, có thể cài đặt chu trình nhiệt như sau (Bảng 6). Sau khi hoàn thành bước ủ, ly tâm nhanh các mẫu.

Bảng 6. Tách mạch và phân mảnh DNA bằng máy luân nhiệt

6. Chuẩn bị hóa chất đánh dấu Labeling Master Mix, chứa cyanine-3 hoặc cyanine-5 trên khay đá lạnh với các thành phần theo thứ tự trong Bảng 7:

Bảng 7. Chuẩn bị Label Master Mix

7. Thêm 19 µL Labeling Master Mix vào mỗi mẫu DNA, tổng thể tích phản ứng lúc này là 50 µL. Pipet lên xuống nhẹ để trộn đều.

8. Ủ mẫu:

- Chuyển các mẫu vào ủ nhiệt độ 37°C trong 2 tiếng

- Chuyển sang 65°C và ủ trong 10 phút để bất hoạt enzyme.

- Chuyển mẫu sang khay đá lạnh.

9. Trường hợp sử dụng máy luân nhiệt, có thể cài đặt chu trình nhiệt như Bảng 8 sau:

Bảng 8. Phản ứng đánh dấu DNA bằng máy luân nhiệt

10. Sau khi hoàn thành bước ủ, ly tâm nhanh các mẫu. Mẫu DNA đã đánh dấu huỳnh quang có thể lưu trữ ở -20°C trong điều kiện tối.

4.1.4.2 Tinh sạch sản phẩm DNA đánh dấu (Purification of labeled DNA) Mẫu DNA đã đánh dấu được tinh sạch bằng cột Purification Column. Lưu ý: Tuyệt đối tách riêng các mẫu DNA được đánh dấu cyanine-3 và cyanine-5 khi thực hiện bước tinh sạch này.

- Ly tâm nhanh các mẫu DNA đã đánh dấu (1 phút, 6000 x g).

- Thêm 430 µL 1xTE (pH 8,0) vào mỗi mẫu.

- Với mỗi mẫu DNA cần tinh sạch, đặt 1 cột tinh sạch vào ống thu mẫu 2-mL và đánh dấu tên từng mẫu. Chuyển mẫu DNA vào cột.

- Đậy kỹ nắp cột, ly tâm trong 10 phút ở 14000 x g, nhiệt độ phòng. Đổ bỏ phần dung dịch và đặt cột vào lại ống thu mẫu.

- Thêm 480 µL 1xTE (pH 8,0) vào mỗi cột. Ly tâm trong 10 phút 14000 x g trong nhiệt độ phòng. Đổ bỏ phần dung dịch.

- Chuyển cột sang ống thu mẫu 2-mL mới, đánh dấu tên mẫu tương ứng, lưu ý quay ngược cột lại khi đặt vào ống. Ly tâm trong 1 phút ở 1000 x g trong nhiệt độ phòng để thu mẫu tinh sạch. Thể tích của mỗi mẫu vào khoảng 20 - 32 µL.

- Thêm 1xTE (pH 8,0) hoặc sử dụng Vacuum Concentrator để cô đặc mẫu đạt đến thể tích tương ứng trong Bảng 9.

- Trộn đều mẫu. Nếu mẫu khô hoặc tủa sau quá trình cô đặc, ủ mẫu trên khay đá trong 5 phút, sau đó pipet lên xuống 10 lần để tan mẫu.

- Lấy 1,5 µL mỗi mẫu để thực hiện đánh giá lượng thu được (Yield) và hoạt tính cụ thể của các mẫu nhuộm huỳnh quang (Specific Activity).

- Trong ống 1,5 mL Rnase-free Microfuge Tube hoặc ống 200 µL Thin- Wall, trộn mẫu DNA thực (đánh dấu cyanine-5) và mẫu DNA chứng (đánh dấu cyanine-3) theo tỷ lệ tương ứng trong Bảng 9.

Bảng 9. Thể tích mẫu và tổng thể tích hỗn hợp mẫu đánh dấu

Để xác định lượng thu được (Yield)và tỷ lệ đánh dấu (Degree of Labeling) và hoạt tính cụ thể của từng loại huỳnh quang (Specific Activity), sử dụng NanoDrop 8000 hoặc 2000 UV-Vis Spectrophotometer

4.1.4.3 Lai DNA (DNA Hybridization)

a) Chuẩn bị dung dịch khóa nền 10x Blocking Agent

- Thêm 1,35 mL nước Dnase/Rnase-free vào ống chứa 10x aCGH Blocking Agent đông khô.

- Giữ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút và vortex đến khi tan đều trước khi sử dụng hoặc trữ lạnh.

Lưu ý: 10x Blocking Agent đã hòa tan có thể duy trì chất lượng trong 120 ngày khi trữ ở -20°C, chỉ rã đông tối đa 3 lần.

b) Chuẩn bị mẫu DNA đánh dấu để thực hiện lai (hybridization)

- Cài đặt nhiệt độ các block nhiệt hoặc bể điều nhiệt ở 98°C, 37 °C, đảm bảo thiết bị đạt đến nhiệt độ yêu cầu; hoặc sử dụng máy luân nhiệt để cài đặt các nhiệt độ trên.

- Chuẩn bị hóa chất lai Hybridization Master Mix theo các thành phần tương ứng với bộ kit lai.

- Thêm 71 µL Hybridization Master Mix vào mẫu hỗn hợp DNA thực (Cyanine-5) và DNA chứng (Cyanine-3) (39 µL), tổng thể tích phản ứng là 110 µL.

- Pipet lên xuống để trộn đều, ly tâm nhanh để tập trung dung dịch xuống đáy ống.

- Chuyển mẫu vào ủ ở 98°C trong 3 phút, sau đó chuyển nhanh mẫu sang 37°C ủ trong 30 phút.

- Trường hợp sử dụng máy luân nhiệt, có thể cài đặt chu trình nhiệt như Bảng 11 sau:

Bảng 11. Nhiệt độ cho phản ứng lai bằng máy luân nhiệt

Lấy các ống mẫu, ly tâm nhanh 1 phút ở 6000 x g để thu mẫu sẵn sàng cho phản ứng lai ở đáy ống.

Lưu ý: Mẫu đã rã đông phải được thực hiện phản ứng lai ngay lập tức. Nếu không, duy trì hỗn hợp ở nhiệt độ 37°C cho đến khi lai.

c) Lắp slide vào buồng lai

- Đặt một slide đệm (gasket slide) sạch vào đáy buồng Agilent SureHyb, hướng mặt slide đệm có đánh dấu lên trên và thẳng hàng với phần hình chữ nhật trên đáy buồng. Đảm bảo slide nằm bằng phẳng và không bị chênh.

- Pipet lấy 100 µL mẫu lai và nhả ra chậm, trải đều mẫu lên bề mặt slide đệm.

Lưu ý: Duy trì nhiệt độ gần 37°C nhất để đảm bảo hiệu suất phản ứng.

Có thể thực hiện từng mẻ phản ứng nhỏ, và bố trí phản ứng trên khay nhiệt, lò nhiệt hoặc máy luân nhiệt.

- Đặt microarray slide lên trên slide đệm, sao cho mặt phản ứng (active side) tiếp xúc với slide đệm và mặt có mã vạch hướng lên trên, nhãn “Agilent” hướng xuống dưới. Chỉnh slide cho bằng phẳng và không bị chênh.

- Đậy nắp buồng SureHyb lại và trượt thanh kẹp vào để khóa chặt 2 slide với nhau.

- Xoay ngang buồng để mặt microarray slide ướt đều bằng cách quan sát các bóng khí giữa 2 slide di chuyển. Gõ nhẹ nếu cần để di chuyển các bóng khí, đảm bảo mặt slide tiếp xúc đều với dung dịch.

d) Phản ứng lai

Đặt buồng lai vào khay của lò, bắt đầu từ vị trí giữa khay. Đặt tốc độ xoay là 20 rpm, nhiệt độ 67°C trong 24 tiếng.

Lưu ý:

+ Sắp xếp các slide sao cho khay chứa được cân bằng trước khi vận hành lò xoay.

+ Lò phản ứng lai phải được hiệu chuẩn định kỳ để đảm bảo kết quả tốt.

4.1.4.4 Rửa (Microarray Wash)

Lưu ý: Bước rửa microarray phải được thực hiện trong điều kiện ozone ≤ 5 ppb. Xác định mức ozone trong phòng thí nghiệm để chọn quy trình rửa phù hợp.

a) Ủ ấm dung dịch Wash Buffer 2

- Nhiệt độ của dung dịch Agilent Oligo aCGH/ChIP-on-Chip Wash Buffer 2 phải được duy trì ở 37°C cho hiệu suất tối ưu.

- Lấy lượng buffer cần dùng sang chai chứa đã tiệt trùng, ủ ấm trong tủ ủ hoặc bể điều nhiệt ở 37°C qua đêm.

- Đặt đĩa nhuộm slide, đĩa 1,5 L, và bình chứa 1-2 L nước Milli-Q vào tủ ấm hoặc bể điều nhiệt ở 37°C qua đêm.

b) Rửa với nước Milli-Q

Tráng kỹ đĩa nhuộm slide, khay đựng slide, đũa khuấy bằng nước Milli-Q trước khi dùng. Tráng rửa 5 lần.

c) Rửa slide microarray

Bảng 12. Điều kiện rửa microarray

Luôn sử dụng Wash Buffer mới, thay mới sau mỗi quy trình rửa (tối đa 5 slide)

- Đổ đầy đĩa nhuộm slide #1 với Agilent Oligo aCGH/ChIP-on-Chip Wash Buffer 1 ở nhiệt độ phòng

- Chuẩn bị đĩa #2:

+ Đặt khay chứa slide vào đĩa nhuộm slide #2

+ Bỏ que khuấy từ vào, đổ đầy đĩa #2 với Wash Buffer 1 ở nhiệt độ phòng

+ Đặt đĩa #2 lên dụng cụ khuấy từ

- Chuẩn bị đĩa #3:

+ Đặt đĩa 1,5 L đã ủ ấm lên dụng cụ khuấy từ có gia nhiệt.

+ Đặt đĩa nhuộm slide #3 vào đĩa 1,5 L

+ Đổ đầy đĩa 1,5 L bằng nước Milli-Q ở 37°C

+ Đổ đầy đĩa nhuộm slide #3 bằng Wash Buffer 2 ở 37°C.

+ Bỏ que khuấy từ vào, bật chế độ gia nhiệt ở 37°C. Theo dõi nhiệt độ bằng nhiệt kế.

- Thực hiện rửa với từng slide, lấy buồng lai từ tủ ủ và tiếp tục quay những buồng còn lại.

- Chuẩn bị tháo buồng lai:

+ Đặt buồng lai trên mặt phẳng, tháo lỏng ốc theo ngược chiều kim đồng hồ.

+ Trượt thanh kẹp ra, gỡ bỏ nắp buồng.

+ Lấy 2 slide (slide đệm - slide microarray) ra mà không để 2 slide tách rời nhau. Giữ mặt có mã vạch hướng lên trên, chuyển 2 slide vào đĩa #1

+ Thả nhẹ 2 slide vào đĩa #1 đã chuẩn bị trước.

- Trong đĩa #1, nhẹ nhàng tách 2 slide ra từ phía đầu có mã vạch bằng đầu nhíp, giữ slide ngập dưới dung dịch. Lấy slide microarray ra. Lưu ý luôn giữ ở góc có mã vạch hoặc bên cạnh slide, tuyệt đối không chạm vào mặt slide. Chuyển sang nhanh và sang đĩa #2.

- Lặp lại từ bước 1 đến 6 cho 4 slide còn lại. Mỗi lần chỉ rửa đồng thời tối đa 5 slide.

- Khi đã đủ 5 slide trong đĩa #2, bật khuấy từ đến 350 rpm trong 5 phút. Điều chỉnh tốc độ vừa phải.

- Rửa slide trong đĩa #3:

- Chuyển khay chứa slide sang đĩa nhuộm slide #3 có chứa Wash Buffer 2 ở 37°C, bật khuấy từ, rửa ít nhất 1 phút, nhưng không quá 2 phút.

- Nhấc khay chứa slide chậm và nhẹ nhàng để hạn chế dung dịch bám lại trên slide.

- Đổ bỏ dung dịch Wash Buffer 1 và Wash Buffer 2 sau khi sử dụng cho một lần rửa.

- Đọc slide ngay sau khi rửa để hạn chế ảnh hưởng của các tác nhân oxi hóa trong môi trường đến tín hiệu. Có thể trữ slide trong hộp chứa slide màu cam trong hộp khí N2, trong điều kiện tối.

d) Đặt slide vào khay giữ slide

Đối với hệ thống SureScan Microarray Scanner

- Nhẹ nhàng đặt phần slide không có mã vạch nằm lên phần mép của khay giữ.

- Hạ nhẹ slide xuống khay giữ, đảm bảo mặt phản ứng (active side) có chữ “Agilent” hướng lên trên và đối diện với nắp đậy

- Đậy nắp nhựa, nhấn nhẹ đến khi nghe tiếng khớp.

4.1.4.5 Đọc tín hiệu xét nghiệm (Microarray Scanning and Analysis)

- Đặt khay giữ slide vào khung quét của máy

- Kiểm tra tình trạng thiết bị.

- Bắt đầu quét, chọn Start Scan.

4.2. Nhận định kết quả

- Sau khi hoàn tất quét slide trên hệ thống Agilent SureScan, phần mềm CytoGenomics sẽ tự động xuất kết quả bao gồm cả báo cáo QC và sai số.

- Các biến thể số lượng bản sao được phân 5 loại: gây bệnh, có khả năng gây bệnh, lành tính, có khả năng lành tính, chưa rõ chức năng. Việc phân tích và phân loại CNV dựa vào phần mềm đi kèm, các nguồn dữ liệu như Decipher, Clinvar, OMIM.

- Xét nghiệm cha mẹ có thể cần thiết để đánh giá thêm khả năng gây bệnh của một sự thay đổi số lượng bản sao. Một số trường hợp các cơ sở dữ liệu sẵn có không thể phân loại biến thể thì có thể cân nhắc một số yếu tố bao gồm kích thước và thành phần gen trong vùng biến thể để giúp giải thích kết quả.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét nghiệm.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

- Sai sót:

+ Giá trị OD260/230 thấp

+ Nồng độ DNA đầu vào quá cao hoặc thấp

- Xử trí:

+ Tinh sạch lại DNA

+ Đảm bảo hiệu chuẩn máy đo quang phổ bằng dung dịch đệm thích hợp

+ Đảm bảo gDNA hoàn toàn ở trong dung dịch bằng cách hút lên và xuống. Nếu cần, ủ ở 37°C trong 30 phút. Nếu nồng độ gDNA > 350 ng/μl, pha loãng 1:2 trong Buffer AE hoặc 1×TE (pH 8,0). Định lượng lại để đảm bảo định lượng là chính xác.

+ Nếu cần, hãy tinh sạch lại DNA.

5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật

- Sai sót: Khả năng đánh dấu huỳnh quang lên DNA thấp

- Xử trí:

+ Bảo quản Cyanine dUTP ở -20°C. Giữ enzyme trên đá và trở về -20°C như nhanh nhất có thể.

+ Kiểm tra kỹ thời gian ủ và nhiệt độ (sử dụng máy đã hiệu chuẩn nhiệt kế), và sử dụng máy luân nhiệt có nắp gia nhiệt.

+ Sự bay hơi có thể là vấn đề khi xử lý mẫu ở nhiệt độ cao nhiệt độ. Đảm bảo rằng các ống mẫu được đậy kín hoặc sử dụng đĩa Heat Sealer để tránh bay hơi.

+ Đảm bảo các pipet không bị hiệu chỉnh.

+ Đảm bảo gDNA, hoá chất và master mix được trộn đều.

5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật

- Sai sót: Kết quả phân tích không phù hợp với biểu hiện lâm sàng và chẩn đoán bệnh.

- Xử trí: Cần phân tích kết quả và đôi chiếu lâm sàng.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Yêu cầu thực hiện nội kiểm chất lượng.

- Yêu cầu thực hiện ngoại kiểm hoặc so sánh liên phòng hoặc kiểm tra mẫu mù. (Nếu có)

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Agilent Oligonucleotide Array-Based CGH for Genomic DNA Analysis Enzymatic Labeling for Blood, Cells, or Tissues (with a High Throughput option) Protocol, Version 7.5, June 201.

2. Slater Howard R., Bailey Dione K., Ren Hua et al. High-resolution identification of chromosomal abnormalities using oligonucleotide arrays containing 116,204 SNPs. American journal of human genetics.2005;77(5):709-726

3. Bejjani Bassem A, Saleki Reza, Ballif Blake C et al. Use of targeted array-based CGH for the clinical diagnosis of chromosomal imbalance: Is less more? American Journal of Medical Genetics Part A. 2005;134(3):259-267.

4. Kirchhoff, Maria Rose, Hanne Lundsteen et al. High resolution comparative genomic hybridisation in clinical cytogenetics. Journal of Medical Genetics. 2001;38(11):740-744

9. XÉT NGHIỆM CÁC GEN BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX REAL- TIME PCR

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích kỹ thuật

Xét nghiệm các gen bằng kỹ thuật Multiplex Real-time PCR nhằm phát hiện các đột biến đã biết, đồng thời ở nhiều gen phục vụ cho chẩn đoán, tiên lượng và điều trị bệnh.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Multiplex PCR là một phương pháp sinh học phân tử phổ biến nhằm khuếch đại nhiều trình tự DNA chỉ trong một phản ứng PCR. Trong quá trình phân tích PCR đa mồi, nhiều trình tự sẽ được khuếch đại cùng lúc sử dụng nhiều cặp mồi, tất cả các thành phần được bổ sung vào cùng một ống phản ứng. Như một phương pháp cải tiến của phản ứng PCR thông thường, phương pháp này giúp rút ngắn thời gian thực hiện mà lại không ảnh hưởng tới kết quả thí nghiệm. Vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR đơn lẻ (Single PCR) là hiện tượng âm tính giả do sai về các thành phần hay chu trình nhiệt, cũng có khi lại là hiện tượng dương tính giả do bị nhiễm. Phương pháp multiplex PCR đã khắc phục được hiện tượng âm tính giả do mỗi sản phẩm khuếch đại sẽ cung cấp một giá trị giúp kiểm tra các phân đoạn được khuếch đại khác.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 01 người.

2.2. Vật tư

- Ống đựng máu chứa chất chống đông K2 EDTA;

- Dao cắt bệnh phẩm loại sử dụng một lần;

- Lam kính;

- Lưỡi dao mổ;

- Ống falcon 15mL;

- Ống falcol 50 mL;

- Đầu côn 10 μl có lọc;

- Đầu côn 20 μl có lọc;

- Đầu côn 200 μl có lọc;

- Đầu côn 1mL có lọc;

- Ống thu mẫu có nắp 1,5 mL tiệt trùng;

- Ống thu mẫu có nắp 2,0 mL tiệt trùng;

- Ống PCR 0,2 mL;

- Ống chuyên dụng đo Qubit 0,5mL;

- Kit đo nồng độ và chất lượng DNA/RNA;

- Kit tách ctDNA, DNA/RNA;

- Kit phát hiện đột biến gen bằng Multiplex Real-time PCR;

- Cồn chuyên dụng cho sinh học phân tử;

- Xylene;

- Nước tinh sạch chuyên dùng trong sinh học phân tử;

- Găng tay cao su không bột tan;

- Giấy lau không bụi.

2.3. Trang thiết bị

- Pipet bán tự động có thể điều chỉnh 0,1 - 10μl, 10 - 100μl, 200 - 1000μl;

- Tủ thao tác PCR;

- Tủ lạnh 4°C;

- Tủ lạnh -20°C;

- Giá để ống;

- Khay giữ lạnh;

- Thùng rác đựng đầu côn và hoá chất;

- Máy ly tâm;

- Máy vortex;

- Máy Spin down;

- Máy đo nồng độ DNA;

- Tủ An toàn sinh học;

- Máy Real-time PCR.

2.4. Chuẩn bị bệnh phẩm

- Loại mẫu bệnh phẩm: Mẫu bệnh phẩm mô, mẫu mô đã được cố định và vùi nến (FFPE); mẫu máu; mẫu dịch cơ thể khác.

- Tiêu chuẩn mẫu bệnh phẩm: đảm bảo về điều kiện bảo quản và cách lấy mẫu đúng theo hướng dẫn của bộ kit.

- Quy định vận chuyển, bảo quản, lưu trữ bệnh phẩm, thời gian chuyển đến phòng xét nghiệm: Mẫu được cho vào hộp đựng bệnh phẩm và vận chuyển đến phòng xét nghiệm trong vòng 4 giờ kể từ khi lấy mẫu (đối với mẫu máu/dịch cơ thể).

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy định, ví dụ một số thông tin chung như: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm, kết quả chẩn đoán giải phẫu bệnh (nếu có) …

2.6. Thời gian thực hiện xét nghiệm

Thời gian thực hiện xét nghiệm từ lúc tiếp nhận bệnh phẩm đến khi trả kết quả khoảng từ 12 đến 18 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện xét nghiệm

Phòng xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử.

3. AN TOÀN

- Đảm bảo an toàn cho người thực hiện xét nghiệm, dự phòng nguy cơ trước, trong và sau xét nghiệm.

- Hiệu chuẩn vật tư, thiết bị định kỳ.

- An toàn điện và phòng chống cháy nổ.

- Đảm bảo đầy đủ bảng chỉ dẫn an toàn từng loại hóa chất.

- Đảm bảo an toàn sinh học.

- Đảm bảo các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng…

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Lập biểu mẫu

Lập danh sách mẫu xét nghiệm và điền các bước thực hiện xét nghiệm các gen từ bằng kỹ thuật Multiplex Real-time PCR.

4.2. Chuẩn bị môi trường làm việc

- Khử nhiễm dụng cụ, thiết bị, bề mặt, không gian làm việc.

- Kiểm tra và chuẩn bị đủ vật tư tiêu hao và dụng cụ cần thiết.

4.3. Chuẩn bị mẫu DNA/RNA

- Quy trình tách chiết để thu được DNA tinh sạch theo Kit tách DNA;

- Đánh giá nồng độ và chất lượng DNA tách chiết từ mẫu bệnh phẩm sử dụng bộ kit chuyên dụng.

- Lấy các mẫu DNA tách chuẩn bị cho xét nghiệm xét nghiệm các gen từ bằng kỹ thuật Multiplex Real-time PCR.

4.3. Thực hiện kỹ thuật Multiplex Real-time PCR:

- Đưa các thành phần cần thiết của phản ứng ra nhiệt độ phòng 10 phút để rã đông hoàn toàn.

- Trộn lẫn các thành phần sau vào một ống 0,2 mL: Buffer, dNTPs, MgCl2 (nếu trong Buffer chưa có), hỗn hợp mồi (gồm các cặp mồi phát hiện đột biến được trộn theo tỷ lệ nhất định), enzym Taq polymerase, nước khử ion vô trùng, DNA/RNA khuôn.

- Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn; Đặt vào máy PCR; Chọn chương trình; Bấm start để máy chạy.

- Phân tích kết quả:

+ Kết quả từ quá trình Multiplex Real-time PCR được phân tích tùy theo mục đích sử dụng và dựa theo hướng dẫn phân tích của từng bộ kit xét nghiệm.

+ Trong quá trình phân tích kết quả, trước hết cần kiểm tra mẫu chứng. Sau đó, tiến hành phân tích mẫu nếu mẫu chứng đạt yêu cầu.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

- Mẫu bệnh phẩm không đạt tiêu chuẩn:

+ Thực hiện lấy lại mẫu.

+ Đảm bảo yêu cầu về điều kiện vận chuyển và bảo quản mẫu.

- Mẫu sau khi tách chiết không đảm bảo chất lượng và số lượng:

+ Thực hiện tách chiết lại theo đúng quy trình.

+ Yêu cầu lấy lại mẫu để tách chiết lại trong trường hợp cần thiết.

5.2 Trong khi thực hiện kỹ thuật

- Mẫu đối chứng không đạt:

+ Kiểm tra điều kiện bảo hóa chất xét nghiệm.

+ Chạy đánh giá lại bộ kit và mẫu đối chứng

- Mẫu bệnh phẩm không đạt điều kiện phân tích:

+ Kiểm tra điều kiện bảo hóa chất xét nghiệm.

+ Kiểm tra lại chất lượng DNA, tách chiết lại nếu cần thiết.

5.3 Sau khi thực hiện kỹ thuật

Sai sót trong quá trình ghi nhận và trả kết quả.

- Kiểm tra lại kết quả đã ghi nhận.

- Thực hiện lại quy trình trả kết quả.

6. YÊU CẦU ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Yêu cầu thực hiện nội kiểm.

- Yêu cầu thực hiện ngoại kiểm hoặc kiểm tra mẫu mù.

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Quyết định 5530/QĐ-BYT ngày 25/12/2015 của Bộ y tế Hướng dẫn quy trình thực hành chuẩn trong quản lý chất lượng xét nghiệm.

2. Quyết định 3376/QĐ-BYT ngày 30/08/2023 của Bộ y tế Ban hành “Đề cương Quy trình kỹ thuật xét nghiệm.

3. Markoulatos P., Siafakas N. and Moncany M. (2002), Multiplex Polymerase Chain Reaction: A Practical Approach, Journal of Clinical Laboratory Analysis, (16), 47-51.

10. XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI/ TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH ĐƠN GEN (PGT-M) BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN SANGER

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Kỹ thuật xét nghiệm di truyền trước làm tổ bệnh đơn gen bằng kỹ thuật giải trình tự gen Sanger nhằm xác định kiểu gen của phôi để sàng lọc các phôi không bệnh hoặc hoàn toàn không mang gen bệnh.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Xét nghiệm di truyền trước làm tổ bệnh đơn gen (Preimplantation genetic testing for monogenic gene diseases - PGT-M) là một loại xét nghiệm di truyền phát hiện các đột biến di truyền đơn gen trên phôi, qua đó ngăn ngừa sự chuyển phôi mắc bệnh di truyền trên 1 vài gen cụ thể. Giải trình tự Sanger được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định các đột biến điểm và là kỹ thuật thường được ứng dụng trong PGT-M bởi tính chính xác và độ tin cậy cao. Phương pháp này thực hiện dựa trên kỹ thuật giải trình tự Sanger bằng việc dùng các máy giải trình tự động sử dụng các ddNTP có đánh dấu huỳnh quang giúp cho việc xác định trình tự gen được tiến hành một cách tự động và chính xác. Từ đó cho phép phát hiện được các đột biến gen khi so sánh với trình tự gen tham chiếu.

Do mẫu phôi sinh thiết được chỉ chứa vài tế bào, vì vậy trước khi thực hiện PGT-M, thường phải qua bước khuếch đại toàn bộ hệ gen-WGA (Whole genome amplification) để đủ lượng DNA cho các phân tích tiếp theo.

2. CHUẨN BỊ

2. Người thực hiện

- Bác sĩ: 02 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 02 người.

2.2. Vật tư

- Bộ kit khuếch đại toàn bộ hệ gen (tuỳ hãng).

- Bột agarose.

- Ethidium bromide hoặc tương đương.

- TBE 0,5X.

- Ladder DNA (100bp).

- Mastermix.

- Các mồi khuếch đại đoạn gen cần giải trình tự.

- Nước khử ion.

- Dung dịch Hi-Di.

- Exo SAP- IT hoặc tương đương.

- Bộ kit BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit hoặc tương đương.

- BigDye XTerminator™ Kit hoặc tương đương.

- Ống li tâm đáy nhọn 1,5 mL.

- Đầu côn các loại: 10 µL, 100 µL, 1000 µL.

- PCR tube.

- Plate PCR 96 giếng.

2.3. Trang thiết bị

- Máy ủ nhiệt có lắc.

- Máy Vortex.

- Máy ly tâm dành cho ống li tâm đáy nhọn 1,5mL.

- Máy đo độ tinh sạch.

- Máy spin down.

- Máy Speedvac.

- Bộ dụng cụ pipet: micropipet 2, 10, 100 và 1000 µL.

- Buồng thao tác PCR

- Máy PCR.

- Máy điện di.

- Máy soi và chụp ảnh gel.

- Máy điện di mao quản (SeqStudio Genetic Analyzer, ABI-3130 (XL), ABI-3500 (XL) hoặc tương đương.

- Phần mềm phân tích kết quả (Bioedit sequence alignment editor) hoặc tương đương.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Chuẩn bị người bệnh: Gia đình được giải thích cặn kẽ về việc lấy mẫu sinh thiết phôi ngày 5 làm xét nghiệm PGT-M bằng cách lấy từ 5 đến 7 tế bào của phôi. Việc sinh thiết này không làm ảnh hưởng đến chất lượng phôi.

- Loại mẫu bệnh phẩm: mẫu phôi.

- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu, bảo quản: Tế bào (phôi 5 ngày) được thu vào ống PCR cùng với một lượng tối thiểu dung dịch PBS 1X sao cho thể tích sau khi chuyển chỉ là 2,5 μl.

- Điều kiện bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm: bảo quản ở nhiệt độ phòng (25°C) không quá 24h.

- Tiêu chuẩn mẫu bệnh phẩm (thể tích, số lượng, chất lượng…): tế bào phôi được lấy vào ống PCR sạch 0,2 mL, đủ 2,5 μl. Ống đựng tế bào phôi sinh thiết luôn phải đặt ở trạng thái đứng. Mẫu được lấy theo Quy trình hướng dẫn lấy mẫu tại labo IVF.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Kiểm tra phiếu xét nghiệm: Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về phôi: cặp vợ chồng: mã số phôi, họ tên vợ và chồng, tuổi, chẩn đoán lâm sàng, chỉ định xét nghiệm, ngày sinh thiết.

- Kiểm tra lại các thủ tục hành chính theo quy định.

- Kiểm tra lại chỉ định/chống chỉ định (nếu có).

- Kiểm tra họ tên, tuổi, thông tin vợ chồng.

- Kiểm tra lại các xét nghiệm cần thiết.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật

Từ 48 đến 72 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Các phòng xét nghiệm đủ điều kiện thực hiện kỹ thuật.

3. AN TOÀN

- Quản lý các nguồn điện, áp dụng phòng ngừa biện pháp an toàn điện chung cho các thiết bị trong phòng xét nghiệm.

- Các hóa chất thực hiện có thể là các chất nguy hại sinh học hoặc dễ gây cháy nổ, tham khảo dữ liệu an toàn của từng hoá chất để kiểm soát rủi ro có thể có.

- Các mẫu sinh học có thể có chứa nhân tố lây nhiễm sinh học, cần được coi là nguy cơ sinh học tiềm ẩn. Đảm bảo thực hiện an toàn cá nhân bằng các trang thiết bị như trang phục phòng xét nghiệm, khẩu trang, găng tay, kính mắt…

- Chú ý thao tác với các thiết bị có nhiệt độ cao như máy ủ nhiệt có lắc, máy Speedvac, máy PCR.

- Khi có sự cố cần báo cáo kịp thời để có biện pháp ngăn ngừa rủi ro và khắc phục hậu quả.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước tiến hành

4.1.1. Bước 1

Tiến hành khuếch đại toàn bộ hệ gen của phôi (WGA - whole genome amplification) bằng kít WGA dùng cho tế bào đơn (Single cell) theo quy trình của nhà sản xuất. Tham khảo quy trình khuyếch đại hệ gen của bộ kit REPLI- g Single Cell trong phụ lục 1 của quy trình này.

4.1.2. Bước 2

Khuếch đại đoạn trình tự gen chứa đột biến:

Dựa vào thông số của cặp mồi thiết kế nhằm khuếch đại đoạn gen chứa đột biến để xác định nhiệt độ gắn mồi. Nhiệt độ gắn mồi (Ta ºC) có thể ước lượng thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của cặp mồi từ 3-5ºC. Việc xác định nhiệt độ gắn mồi cũng có thể xác định chính xác bằng cách tiến hành phản ứng Gradient-PCR trong dải nhiệt độ nhất định.

Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng khuếch đại được minh hoạ ở bảng:

Tiến hành điện di agarose, nhuộm và đánh giá

- Chạy điện di sản phẩm PCR trên agarose 2%, thời gian 30 phút với hiệu điện thế 200V và cường độ dòng điện là 100mA.

- Nhuộm bản gel sau khi chạy điện di trong dung dịch EtBr 10 μg/mL trong 10 phút, rửa bản gel sau khi nhuộm bằng nước cất, chụp ảnh gel bằng máy chụp gel.

- Phản ứng khuếch đại thành công khi các băng điện di sản phẩm khuếch đại xuất hiện rõ, đúng với kích thước của các cặp mồi đã thiết kế, không có băng phụ thì có thể tiến hành giải trình tự. Trường hợp có band phụ, cần cắt và tinh sạch từ gel.

4.1.3. Bước 3

- Giải trình tự Sanger bằng bộ kit Bộ kit thương mại.

- Trong phần này sẽ trình bày quy trình giải trình tự Sanger bằng bộ BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Thermo fisher scientific [4].

- Tinh sạch sản phẩm khuếch đại.

- Tinh sạch sản phẩm bằng Exo SAP- IT nhằm loại bỏ các đoạn mồi dư thừa và các nucleotide chưa hợp nhất bằng enzym. Thành phần và chu trình tinh sạch được thực hiện như sau:

- Phản ứng Sanger

Tùy vị trí đột biến trong đoạn gen khuếch đại để tiến hành giải trình tự Sanger mồi xuôi hay mồi ngược hay cả hai.

Thành phần và chu trình nhiệt chạy phản ứng Sanger được thực hiện như sau:

- Tinh sạch sản phẩm sau phản ứng PCR Sanger sequencing bằng một trong hai phương pháp sau:

Phương pháp 1: Tinh sạch bằng BigDye XTerminator™:

Lưu ý: Sử dụng ống chứa dung dịch dùng một lần và micro pipet P200 8 kênh nếu có, để tạo thuận lợi cho quá trình làm sạch. Sử dụng đầu tip pipet có lỗ rộng khi bơm dung dịch BigDye Xterminator™.

Lưu ý: Nếu sử dụng Máy phân tích DNA 3730, có thể sử dụng kỹ thuật hàn nhiệt tiêu chuẩn. Quy trình này mô tả việc niêm phong tấm bằng MicroAmp™ màng dính trong suốt. Các MicroAmp™ màng dính trong suốt phải được loại bỏ trước khi đặt đĩa 96 giếng lên thiết bị.

+ Lắc lọ BigDye XTerminator™ bead trong 8 đến 10 giây trước khi trộn với dung dịch SAM.

QUAN TRỌNG! Để làm sạch BigDye XTerminator™ hiệu quả, điều cần thiết là phải giữ các nguyên liệu được trộn đều. Giữ thuốc thử trên đá giữa các bước.

+ Chuẩn bị dung dịch xử lý SAM/BigDye XTerminator™ bead như sau:

Phản ứng tinh sạch sản phẩm PCR Sanger sequencing

+ Lấy màng dính trong suốt MicroAmp™ ra khỏi đĩa 96 giếng.

+ Chia đều thể tích hỗn hợp hạt (dung dịch hạt BigDye XTerminator™ và dung dịch SAM) cho từng mẫu.

QUAN TRỌNG! Trộn đều, bơm dung dịch lên xuống 3-4 lần trước mỗi lần chuyển. Trộn lại dung dịch sau mỗi bước phân phối

+ Dán đĩa 96 giếng bằng màng dính trong suốt MicroAmp™.

+ Lắc đĩa 96 giếng trong 20 phút ở tốc độ 1.800 vòng/phút (đối với Digital VortexGenie™ 2).

+ Trong máy ly tâm xô lắc, ly tâm đĩa 96 giếng ở tốc độ 1.000 × g trong 2 phút.

Lưu ý: Để bảo quản tối đa 10 ngày, hãy dán kín đĩa bằng màng dính trong suốt MicroAmp™ và bảo quản ở 4°C để chuẩn bị điện di mao quản (CE) hoặc ở -20°C cho đến khi sử dụng. Đĩa BigDye XTerminator™ có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng lên đến 48 giờ bao gồm thời gian trên thiết bị giải trình tự.

Phương pháp 2: Tinh sạch bằng phương pháp tủa EtOH/EDTA:

+ Thêm vào toàn bộ sản phẩm 2 µL EDTA 0,125M và 30 µL ethanol 100º. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.

+ Gạn bỏ dịch nổi phía trên, đem làm khô bằng speedvac ở 60ºC trong 10 phút.

+ Sau khi khô hoàn toàn, thêm 10 µL nước khử ion và vortex đều.

- Điện di mao quản

+ Thêm vào mỗi ống 30 µL dung dịch Hi-Di Formamide và đem biến tính tại nhiệt độ 95ºC trong 5 phút. Hạ nhiệt nhanh về 4ºC.

+ Sau biến tính, mẫu trên được sử dụng cho điện di mao quản bằng máy điện di mao quản.

+ Trình tự nucleotide của mỗi đoạn gen sau khi giải trình tự được xác định cả 2 chiều (xuôi và ngược) bằng phần mềm phân tích trình tự.

4.2. Nhận định kết quả

- Tuỳ vào từng loại đột biến, đối chiếu trình tự gen tham chiếu để xác định kết quả tại vị trí xảy ra đột biến đã biết:

- Tại vị trí đột biến chỉ xuất hiện một màu tín hiệu huỳnh quang có nghĩa mẫu phôi ở trạng thái đồng hợp tử (Đồng hợp tử đột biến hoặc đồng hợp tử wildtype).

- Tại vị trí đột biến xuất hiện hai màu tín hiệu huỳnh quang có nghĩa mẫu phôi ở trạng thái dị hợp tử (Mang gen đột biến).

- Đối với các trường hợp kiểu gen đồng hợp tử gây bệnh, có thể kiểm soát được hiện tượng mất alen (Allelic drop out-ADO) gây âm tính giả. Các trường hợp dị hợp tử phức, cần được kiểm soát bằng phân tích di truyền liên kết.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả kiểu gen của từng phôi theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét nghiệm.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

- Sai sót: Nhận nhầm mẫu.

- Xử trí: Kiểm tra thông tin mẫu, đối chiếu phiếu xét nghiệm cẩn thận.

5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật

5.2.1. Thao tác pipet không chính xác

- Sai sót: Thao tác pipet không chính xác ảnh hưởng đến chất lượng của xét nghiệm.

- Xử trí: Định kỳ kiểm tra chất lượng pipet, tiến hành thao tác với pipet cẩn thận.

5.2.2. Mẫu nhiễm DNA ngoại lai

- Nhiễm DNA ngoại lai dẫn đến kết quả xét nghiệm sai.

- Xử trí: Tiến hành nhân bản toàn bộ hệ gen mẫu phôi trong phòng áp lực dương, thao tác tiến hành cẩn thận. Phản ứng khuếch đại đoạn gen đột biến cần chạy kèm cả mẫu đối chứng âm để kiểm soát ngoại nhiễm. Sinh thiết lại phôi nếu không khắc phục được.

5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật

- Sai sót: Phân tích kết quả sai.

- Xử trí: Cần cẩn trọng phân tích trong các trường hợp, đề phòng hiện tượng mất alen- ADO, hiện tượng mất cân bằng alen-AI (imbalance Allelic ) dẫn đến kết luận sai giữa mẫu phôi mang gen bệnh và bình thường, không mang gen. Trường hợp không kiểm soát được ADO, AI, cần kết hợp phân tích di truyền liên kết bằng các trình tự lặp lại ngắn liên tiếp hoặc hoặc các đa hình nucleotide đơn liên kết với gen bệnh để phân biệt được kiểu gen.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Yêu cầu nội kiểm: mỗi kết quả được phân tích và kết luận bởi hai người có trình độ chuyên môn độc lập. Khi kết quả trùng khớp mới đưa ra kết luận. Nếu kết quả không trùng khớp, kết quả cần được phân tích độc lập bởi một người thứ ba.

- Yêu cầu ngoại kiểm: đối chiếu với kết quả xét nghiệm gen trước đó phát hiện đột biến gây bệnh, so sánh kiểu gen của các thành viên trong gia đình, các mẫu phôi đã có kết quả. (Yêu cầu ngoại kiểm không bắt buộc).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Xu C. M., Lu S. J., Chen S. C., Zhang J. L., Xu C. J., Gao Y., Huang H. F. (2023). Preimplantation genetic testing guidelines of International Society of Reproductive Genetics. Reproductive and Developmental Medicine, 7(01), 3-11.

2. Dorado G., Gálvez S., Rosales T. E., Vásquez V. F., Hernández P. (2021). Analyzing modern biomolecules: the revolution of nucleic-acid sequencing-Review. Biomolecules, 11(8), 1111.

3. Single Cell Kit protocol. Qiagen.

4. BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Protocol. Thermo fisher scientific.

11. XÉT NGHIỆM GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI DNA

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Xác định các biến đổi di truyền bằng kỹ thuật lai DNA để phục vụ tư vấn, chẩn đoán và điều trị các bệnh lý huyết học, di truyền....

1.2. Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật lai DNA ngược trong đó các đầu dò đặc hiệu với nhiều đột biến hay đa hình của một gen sẽ được gắn trên thanh lai và lai với gen đã được khuếch đại. Đầu dò được cố định trên thanh lai là một đoạn oligo có ái lực mạnh và đặc hiệu với trình tự gen mục tiêu. Chiều dài của chúng phù hợp cho phản ứng lai, giúp phân biệt DNA với những sai khác rất nhỏ trong trình tự. Sản phẩm sau PCR được lai với probe trên màng, các thể lai có thể được phát hiện bằng phản ứng với một cơ chất để tạo thành kết tủa có màu. Xét nghiệm sử dụng các thanh teststrip với các vị trí đã được gắn đầu dò phát hiện các đột biến gen.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 02 người.

2.2. Vật tư

2.3. Trang thiết bị

2.3.1. Trang thiết bị trực tiếp

- Máy PCR;

- Hệ thống chụp ảnh gel;

- Máy tính có phần mềm chụp ảnh gel;

- Bể ổn nhiệt;

- Bộ lưu điện;

- Máy điện di;

- Máy trộn mẫu;

- Máy ly tâm loại để bàn;

- Tủ an toàn sinh học cấp II;

- Máy ủ nhiệt kèm lắc rung;

- Máy Vortex;

- Máy ly tâm Spin down;

- Tủ lạnh 2°C-8°C;

- Tủ lạnh âm sâu -20°C;

- Tủ lạnh âm sâu -70°C.

- Bộ pipet các kích cỡ từ 1 µL đến 1000 µL.

2.3.2. Trang thiết bị phụ trợ

- Phần mềm quản lý xét nghiệm;

- Bồn rửa mắt khẩn cấp.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm là 1-2 mL máu toàn phần chống đông EDTA. Bảo quản 2-8°C, giao mẫu đến khoa xét nghiệm trong vòng 72 giờ kể từ khi lấy mẫu.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật

Ước tính từ lúc bắt đầu cho đến khi kết thúc xét nghiệm: 8 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Phòng xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử.

3. AN TOÀN

- Nhân viên phải mang găng tay, khẩu trang và mặc trang phục y tế trong suốt quá trình làm xét nghiệm.

- Phân loại đúng rác thải và loại bỏ rác thải ngay sau quá trình thực hiện xét nghiệm.

- Thực hiện kiểm soát điều kiện môi trường theo “Quy trình theo dõi và kiểm soát điều kiện môi trường”.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

4.1.1 Tách chiết DNA

Sử dụng các bộ kít thương mại, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

4.1.2. Đo nồng độ DNA

Thực hiện các bước kỹ thuật theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

4.1.3. Thực hiện phản ứng PCR

- Lấy hóa chất cho phản ứng PCR và các cặp mồi đặt trên khay trữ lạnh khoảng 10 phút để rã đông hoàn toàn, trộn nhẹ và ly tâm nhanh trong 1-2 giây.

- Chuẩn bị hồ sơ xét nghiệm, tính toán số lượng các thành phần phản ứng.

- Chuẩn bị các ống PCR 0,2 mL. Ghi mã mẫu lên mỗi ống.

- Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR (thao tác trong tủ an toàn sinh học): sử dụng pipet thêm lần lượt từng hóa chất (theo quy trình đã tối ưu) vào một ống 0,2 mL hoặc 1,5 mL. Trộn đều ống hỗn hợp và chia hóa chất đã pha vào mỗi ống phản ứng (số lượng hóa chất chia vào mỗi ống thực hiện theo quy trình đã tối ưu).

- Bổ sung DNA vào mỗi ống tương ứng (nồng độ DNA bổ sung vào mỗi ống PCR theo hướng dẫn tại quy trình đã tối ưu).

- Đặt các ống phản ứng vào máy PCR, chọn chương trình PCR tương thích.

- Lau chùi mặt sàn tủ an toàn sinh học bằng cồn 70%.

Khi trương trình PCR kết thúc, lấy các ống phản ứng ra khỏi máy luân nhiệt.

- Điện di kiểm tra sản phẩm hoặc bao quản sản phẩm PCR ở nhiệt độ 2-8°C.

4.1.4. Điện di sản phẩm PCR

- Chuẩn bị bản gel agarose ở nồng độ thích hợp.

- Nhỏ mẫu vào các vị trí tương ứng trên bản gel, nhỏ mẫu DNA chuẩn (DNA ladder) tương thích.

- Tiến hành điện di ở thời gian và điều kiện điện thế phù hợp.

- Chụp ảnh bản gel và chú thích tên mẫu, ngày xét nghiệm, loại xét nghiệm.

4.1.5. Lai DNA

Thực hiện các bước kỹ thuật theo hướng dẫn đi kèm bộ kit.

4.2. Nhận định kết quả

- Chỉ phân tích kết quả mẫu xét nghiệm khi các mẫu đối chứng trong phản ứng đạt yêu cầu.

- Phân tích kết quả mẫu xét nghiệm dựa vào kích thước của các băng hiển thị trên thanh teststrip. Nhận biết đột biến ở các vị trí vạch trên thanh theo hướng dẫn đi kèm bộ kit.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét nghiệm.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

Kiểm soát các mẫu chứng theo hướng dẫn đi kèm bộ sinh phẩm sử dụng

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Old JM. Screening and genetic diagnosis of haemoglobinopathies. Scand J Clin Lab Invest 2007; 67: 71-86

2. Najmabadi H, Teimourian S, Khatibi T et al. Amplification refractory mutation system (ARMS) and reverse hybridization in the detection of beta- thalassemia mutations. Arch Inn Med 2001; 4: 165-170.

3. Delague V, Kriegsha¨user G, Oberkanins C, Me´garbane´ A. Reverse hybridization vs. DNA sequencing in the molecular diagnosis of Familial Mediterranean fever. Genet Test 2004; 8: 65-68.

12. XÉT NGHIỆM GEN VỚI cfDNA BẰNG KỸ THUẬT DIGITAL- PCR

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Xác định các biến thể của gen thai nhi thông qua DNA lưu hành tự do trong máu mẹ (cfDNA) bằng kỹ thuật digital-PCR.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

- Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật tách chiết, phân lập DNA của thai nhi lưu hành trong máu của thai phụ (mẹ) và xét nghiệm biến thể gen bằng kỹ thuật digital-PCR.

- cfDNA (Cell free DNA) là những đoạn DNA ngắn được giải phóng và lưu hành trong máu mẹ. Những đoạn DNA này là nguồn vật liệu di truyền của thai nhi và có thể được sử dụng để sàng lọc, chẩn đoán sớm các biến thể di truyền ở thai nhi.

- Kỹ thuật digital-PCR là một biến thể của kỹ thuật real-time PCR. Kỹ thuật này không chỉ tăng cường độ nhạy của xét nghiệm mà còn có thể định lượng (bằng phương pháp đếm tuyệt đối - absolute quantification).

- Kết hợp cfDNA với phương pháp digital-PCR được ứng dụng để sàng lọc, chẩn đoán trước sinh không xâm lấn nhằm phát hiện sớm các biến thể di truyền ở thai nhi, hạn chế các tai biến của phương pháp chẩn đoán xâm lấn như chọc ối hoặc sinh thiết gai nhau.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện: