Quyết định 3286/QĐ-BYT năm 2025 về Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử” do Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành

QUYẾT ĐỊNH

VỀ VIỆC BAN HÀNH TÀI LIỆU CHUYÊN MÔN “HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT VỀ DI TRUYỀN - SINH HỌC PHÂN TỬ”

BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ

Căn cứ Luật Khám bệnh, chữa bệnh năm 2023;

Căn cứ Nghị định số 42/2025/NĐ-CP ngày 27 tháng 02 năm 2025 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Y tế;

Căn cứ Thông tư số 23/2024/TT-BYT ngày 18 tháng 10 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành Danh mục kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh;

Căn cứ Quyết định số 622/QĐ-BYT ngày 14 tháng 03 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc thành lập Hội đồng chuyên môn nghiệm thu “Hướng dẫn quy trình chuyên môn kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử”;

Căn cứ Biên bản họp ngày 08 tháng 08 năm 2025 của Hội đồng chuyên môn nghiệm thu “Hướng dẫn quy trình chuyên môn kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử”; Công văn số 1130/HHTM ngày 20 tháng 08 năm 2025 của Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương về việc hoàn thiện Hướng dẫn Quy trình chuyên môn kỹ thuật khám bệnh, chữa bệnh;

Theo đề nghị của Cục trưởng Cục Quản lý Khám, chữa bệnh.

QUYẾT ĐỊNH:

Điều 1. Ban hành kèm theo Quyết định này Tài liệu chuyên môn

“Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử” - Tập 1, gồm 37 quy trình kỹ thuật (Tài liệu chuyên môn kèm theo).

Điều 2. Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử” được áp dụng tại các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh.

Điều 3. Quyết định này có hiệu lực kể từ ngày 01/7/2026.

Điều 4. Các ông, bà: Chánh Văn phòng Bộ; Cục trưởng Cục Quản lý Khám, chữa bệnh; Cục trưởng, Vụ trưởng các Cục, Vụ thuộc Bộ Y tế; Giám đốc các bệnh viện trực thuộc Bộ Y tế; Giám đốc Sở Y tế các tỉnh, thành phố trực thuộc trung ương; Thủ trưởng Y tế các ngành và các cơ quan, đơn vị liên quan chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này./.

HƯỚNG DẪN

QUY TRÌNH CHUYÊN MÔN KỸ THUẬT VỀ DI TRUYỀN - SINH HỌC PHÂN TỬ (TẬP 1)
(Ban hành kèm theo Quyết định số 3286/QĐ-BYT ngày 17 tháng 10 năm 2025 của Bộ trưởng Bộ Y tế)

Chỉ đạo biên soạn, thẩm định

LỜI NÓI ĐẦU

Bộ Y tế đã xây dựng và ban hành Tài liệu “Hướng dẫn Quy trình chuyên môn kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử” năm 2012, 2014, 2016. Hướng dẫn Quy trình kỹ thuật này là căn cứ để cơ sở khám bệnh, chữa bệnh, người hành nghề khám bệnh, chữa bệnh, nhân viên y tế triển khai áp dụng và thực hiện kỹ thuật khám, chữa bệnh.

Trong những năm gần đây, với sự phát triển về khoa học kỹ thuật trên thế giới và năng lực người thực hiện kỹ thuật, nhằm cập nhật, bổ sung những tiến bộ mới và tiếp tục chuẩn hóa quy trình thực hiện kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh, Bộ Y tế đã giao một số bệnh viện làm đầu mối xây dựng, cập nhật Hướng dẫn Quy trình chuyên môn kỹ thuật Di truyền - Sinh học phân tử như Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, Bệnh viện K, Bệnh viện Nhi Trung ương, Bệnh viện Phụ sản Trung ương, Bệnh viện Bạch Mai, các bệnh viện được giao đã huy động và phân công các giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ, bác sĩ chuyên khoa… biên soạn Hướng dẫn quy trình kỹ thuật; tổ chức họp hội đồng khoa học trong bệnh viện để nghiệm thu; biên tập, hoàn thiện theo ý kiến của Hội đồng chuyên môn nghiệm thu do Bộ Y tế thành lập và chịu trách nhiệm về chuyên môn kỹ thuật quy định trong Hướng dẫn quy trình kỹ thuật. Hướng dẫn quy trình kỹ thuật đều được các thành viên biên soạn rà soát với hướng dẫn hiện hành, tham khảo các tài liệu trong nước, nước ngoài để cập nhật phù hợp với thực tế hiện nay.

Bộ Y tế đã thành lập Hội đồng chuyên môn nghiệm thu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật với sự tham gia của một số Vụ, Cục chức năng của Bộ Y tế, các chuyên gia về Di truyền - Sinh học phân tử trong cả nước. Các thành viên Hội đồng đã làm việc với tinh thần trách nhiệm, đóng góp về thời gian, trí tuệ, kinh nghiệm để góp ý, nghiệm thu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật.

Để hoàn thành Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn Quy trình chuyên môn kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử”, Cục Quản lý Khám chữa bệnh - Bộ Y tế trân trọng cảm ơn sự đóng góp công sức, trí tuệ, kinh nghiệm của các giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ, bác sĩ chuyên khoa, chuyên ngành hàng đầu trong lĩnh vực Di truyền Y học và Sinh học phân tử đã tham gia với vai trò là thành viên Ban biên soạn, thành viên Hội đồng góp ý và nghiệm thu Tài liệu chuyên môn.

QUYẾT ĐỊNH

VỀ VIỆC BAN HÀNH TÀI LIỆU CHUYÊN MÔN “HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT VỀ DI TRUYỀN - SINH HỌC PHÂN TỬ”

BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ

Căn cứ Luật Khám bệnh, chữa bệnh năm 2023;

Căn cứ Nghị định số 42/2025/NĐ-CP ngày 27 tháng 02 năm 2025 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Y tế;

Căn cứ Thông tư số 23/2024/TT-BYT ngày 18 tháng 10 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành Danh mục kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh;

Căn cứ Quyết định số 622/QĐ-BYT ngày 14 tháng 03 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc thành lập Hội đồng chuyên môn nghiệm thu “Hướng dẫn quy trình chuyên môn kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử”;

Căn cứ Biên bản họp ngày 08 tháng 08 năm 2025 của Hội đồng chuyên môn nghiệm thu “Hướng dẫn quy trình chuyên môn kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử”; Công văn số 1130/HHTM ngày 20 tháng 08 năm 2025 của Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương về việc hoàn thiện Hướng dẫn Quy trình chuyên môn kỹ thuật khám bệnh, chữa bệnh;

Theo đề nghị của Cục trưởng Cục Quản lý Khám, chữa bệnh.

QUYẾT ĐỊNH:

Điều 1. Ban hành kèm theo Quyết định này Tài liệu chuyên môn

“Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử” - Tập 1, gồm 37 quy trình kỹ thuật (Tài liệu chuyên môn kèm theo).

Điều 2. Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử” được áp dụng tại các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh.

Điều 3. Quyết định này có hiệu lực kể từ ngày 01/7/2026.

Điều 4. Các ông, bà: Chánh Văn phòng Bộ; Cục trưởng Cục Quản lý Khám, chữa bệnh; Cục trưởng, Vụ trưởng các Cục, Vụ thuộc Bộ Y tế; Giám đốc các bệnh viện trực thuộc Bộ Y tế; Giám đốc Sở Y tế các tỉnh, thành phố trực thuộc trung ương; Thủ trưởng Y tế các ngành và các cơ quan, đơn vị liên quan chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này./.

HƯỚNG DẪN

QUY TRÌNH CHUYÊN MÔN KỸ THUẬT VỀ DI TRUYỀN - SINH HỌC PHÂN TỬ (TẬP 1)
(Ban hành kèm theo Quyết định số 3286/QĐ-BYT ngày 17 tháng 10 năm 2025 của Bộ trưởng Bộ Y tế)

Chỉ đạo biên soạn, thẩm định

LỜI NÓI ĐẦU

Bộ Y tế đã xây dựng và ban hành Tài liệu “Hướng dẫn Quy trình chuyên môn kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử” năm 2012, 2014, 2016. Hướng dẫn Quy trình kỹ thuật này là căn cứ để cơ sở khám bệnh, chữa bệnh, người hành nghề khám bệnh, chữa bệnh, nhân viên y tế triển khai áp dụng và thực hiện kỹ thuật khám, chữa bệnh.

Trong những năm gần đây, với sự phát triển về khoa học kỹ thuật trên thế giới và năng lực người thực hiện kỹ thuật, nhằm cập nhật, bổ sung những tiến bộ mới và tiếp tục chuẩn hóa quy trình thực hiện kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh, Bộ Y tế đã giao một số bệnh viện làm đầu mối xây dựng, cập nhật Hướng dẫn Quy trình chuyên môn kỹ thuật Di truyền - Sinh học phân tử như Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, Bệnh viện K, Bệnh viện Nhi Trung ương, Bệnh viện Phụ sản Trung ương, Bệnh viện Bạch Mai, các bệnh viện được giao đã huy động và phân công các giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ, bác sĩ chuyên khoa… biên soạn Hướng dẫn quy trình kỹ thuật; tổ chức họp hội đồng khoa học trong bệnh viện để nghiệm thu; biên tập, hoàn thiện theo ý kiến của Hội đồng chuyên môn nghiệm thu do Bộ Y tế thành lập và chịu trách nhiệm về chuyên môn kỹ thuật quy định trong Hướng dẫn quy trình kỹ thuật. Hướng dẫn quy trình kỹ thuật đều được các thành viên biên soạn rà soát với hướng dẫn hiện hành, tham khảo các tài liệu trong nước, nước ngoài để cập nhật phù hợp với thực tế hiện nay.

Bộ Y tế đã thành lập Hội đồng chuyên môn nghiệm thu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật với sự tham gia của một số Vụ, Cục chức năng của Bộ Y tế, các chuyên gia về Di truyền - Sinh học phân tử trong cả nước. Các thành viên Hội đồng đã làm việc với tinh thần trách nhiệm, đóng góp về thời gian, trí tuệ, kinh nghiệm để góp ý, nghiệm thu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật.

Để hoàn thành Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn Quy trình chuyên môn kỹ thuật về Di truyền - Sinh học phân tử”, Cục Quản lý Khám chữa bệnh - Bộ Y tế trân trọng cảm ơn sự đóng góp công sức, trí tuệ, kinh nghiệm của các giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ, bác sĩ chuyên khoa, chuyên ngành hàng đầu trong lĩnh vực Di truyền Y học và Sinh học phân tử đã tham gia với vai trò là thành viên Ban biên soạn, thành viên Hội đồng góp ý và nghiệm thu Tài liệu chuyên môn.

Trong quá trình biên soạn, biên tập, in ấn tài liệu, mặc dù Ban Biên soạn đã hết sức cố gắng nhưng khó tránh khỏi hoàn hoàn những thiếu sót, chúng tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến từ quý độc giả đồng nghiệp để Tài liệu chuyên môn ngày một hoàn thiện hơn. Mọi ý kiến góp ý xin gửi về Cục Quản lý Khám, chữa bệnh - Bộ Y tế, 138A, Giảng Võ, Hà Nội.

Trân trọng cảm ơn!

NGUYÊN TẮC XÂY DỰNG, BAN HÀNH VÀ ÁP DỤNG HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT TRONG KHÁM BỆNH, CHỮA BỆNH

1. Nguyên tắc xây dựng và ban hành Hướng dẫn quy trình kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh:

a) Hướng dẫn quy trình kỹ thuật được xây dựng và ban hành theo từng chương, chuyên ngành bảo đảm đầy đủ các nội dung cơ bản về chỉ định, chống chỉ định, thận trọng, chuẩn bị đến các các bước thực hiện kỹ thuật theo trình tự thực hiện từ khi bắt đầu đến khi kết thúc thực hiện kỹ thuật;

b) Thời gian thực hiện kỹ thuật, nhân lực, thuốc, thiết bị y tế… (danh mục và số lượng) được quy định trong Hướng dẫn quy trình kỹ thuật căn cứ trên yêu cầu chuyên môn, tính phổ biến, thường quy thực hiện tại cơ sở khám bệnh, chữa bệnh. Trong thực tế triển khai, thời gian thực hiện kỹ thuật, nhân lực, thuốc, thiết bị y tế… (danh mục và số lượng) có thể thay đổi dựa trên cá thể người bệnh, tình trạng bệnh, diễn biến lâm sàng… và điều kiện thực tế hạ tầng, thiết bị, nhân lực của mỗi cơ sở khám bệnh, chữa bệnh;

c) Ngoài địa điểm thực hiện kỹ thuật như phòng phẫu thuật (phòng mổ), phòng thực hiện kỹ thuật (phòng thủ thuật), phòng bệnh... được quy định trong Hướng dẫn quy trình kỹ thuật, kỹ thuật có thể được thực hiện ở các địa điểm khác theo nguyên tắc:

- Kỹ thuật được quy định thực hiện ở phòng bệnh thì kỹ thuật đó được phép thực hiện tại phòng thực hiện kỹ thuật, phòng phẫu thuật;

- Kỹ thuật được quy định thực hiện ở phòng thực hiện kỹ thuật thì kỹ thuật đó được phép thực hiện tại phòng phẫu thuật;

- Các kỹ thuật chỉ được phép thực hiện tại các địa điểm khác trong trường hợp cấp cứu theo quy định pháp luật về khám bệnh, chữa bệnh.

2. Nguyên tắc áp dụng Hướng dẫn quy trình kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh:

a) Cơ sở khám bệnh, chữa bệnh được phép áp dụng toàn bộ Hướng dẫn quy trình kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh do Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành và phải có văn bản do người đứng đầu cơ sở khám bệnh, chữa bệnh phê duyệt việc triển khai áp dụng toàn bộ Hướng dẫn quy trình kỹ thuật do Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành.

b) Trường hợp cơ sở khám bệnh, chữa bệnh xây dựng và ban hành Hướng dẫn quy trình kỹ thuật áp dụng tại cơ sở khám bệnh, chữa bệnh thì tuân thủ theo nguyên tắc xây dựng. Căn cứ Hướng dẫn quy trình kỹ thuật tương ứng do Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành, Thủ trưởng cơ sở khám bệnh, chữa bệnh chỉ đạo xây dựng, ban hành, triển khai, áp dụng phù hợp với đơn vị và hoàn toàn trách nhiệm về việc xây dựng, ban hành, triển khai và áp dụng.

c) Tài liệu chuyên môn Hướng dẫn quy trình kỹ thuật ban hành kèm theo Quyết định này được áp dụng cho các kỹ thuật quy định tại Phụ lục số 02 đồng thời có trong Phụ lục số 01, Thông tư số 23/2024/TT-BYT ngày 18 tháng 10 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành danh mục kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh.

d) Người thực hiện các kỹ thuật khám bệnh, chữa bệnh là người hành nghề có phạm vi hành nghề phù hợp với kỹ thuật khám bệnh, chữa bệnh, theo quy định của Luật Khám bệnh, chữa bệnh, không bị giới hạn bởi các chức danh nghề nghiệp được liệt kê trong từng quy trình kỹ thuật.

đ) Cơ sở khám bệnh, chữa bệnh chỉ được thực hiện kỹ thuật khám bệnh, chữa bệnh sau khi được cấp có thẩm quyền phê duyệt, cho phép và sử dụng thuốc, thiết bị y tế được cấp phép theo quy định hiện hành.

e) Trong quá trình triển khai áp dụng Hướng dẫn quy trình kỹ thuật, nếu có các bất cập hoặc nhu cầu cần sửa đổi, bổ sung, cập nhật…, các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh chủ động cập nhật và ban hành Hướng dẫn quy trình kỹ thuật áp dụng tại cơ sở khám bệnh, chữa bệnh, đồng thời báo cáo, đề xuất Bộ Y tế (Cục Quản lý Khám, chữa bệnh) để xem xét ban hành áp dụng trong cả nước.

MỤC LỤC

1. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ (KARYOTYPE) TẾ BÀO DỊCH ỐI; TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ; GAI RAU

2. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ BẰNG KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG HUỲNH QUANG (QF-PCR)

3. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ BẰNG KỸ THUẬT BOBS

4. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ TẾ BÀO ỐI, GAI RAU BẰNG KỸ THUẬT FISH

5. XÉT NGHIỆM CÔNG THỨC NHIỄM SẮC THỂ (KARYOTYPE) TẾ BÀO MÁU NGOẠI VI; TỦY XƯƠNG; TẾ BÀO MÔ KHÁC

6. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ TẾ BÀO MÁU NGOẠI VI; TỦY XƯƠNG; CÁC TẾ BÀO MÔ KHÁC BẰNG KỸ THUẬT FISH

7. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TIÊU BẢN MÔ BẰNG KỸ THUẬT FISH

8. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ THEO DÒNG TẾ BÀO BẰNG KỸ THUẬT FISH

9. XÉT NGHIỆM TỶ LỆ KHẢM TRONG GHÉP TẾ BÀO GỐC KHÁC GIỚI BẰNG KỸ THUẬT FISH

10. XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT PCR

11. XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR

12. XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR

13. XÉT NGHIỆM GEN TRƯỚC SINH VỚI TẾ BÀO ỐI; GAI NHAU BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN SANGER

14. XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT MLPA

15. XÉT NGHIỆM GIẢI TRÌNH TỰ GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SANGER

16. XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT NGS

17. XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT DNA MICROARRAY

18. XÉT NGHIỆM CÁC BIẾN THỂ GEN ALPHA THALASSEMIA HOẶC BETA THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT LAI DNA

19. XÉT NGHIỆM BIẾN THỂ CÁC GEN GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT NGS

20. XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN VIRUS BẰNG KỸ THUẬT PCR

21. XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN VIRUS BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR

22. XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG VIRUS BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR

23. XÉT NGHIỆM XÁC ĐỊNH HLA (MỘT TRONG SỐ CÁC LOCUS: A, B, C, DR, DQ HOẶC DP) BẰNG KỸ THUẬT PCR-SSO

24. XÉT NGHIỆM XÁC ĐỊNH HLA (MỘT TRONG SỐ CÁC LOCUS: A, B, C, DR, DQ HOẶC DP) BẰNG KỸ THUẬT PCR-SSP

25. XÉT NGHIỆM XÁC ĐỊNH HLA ĐỘ PHÂN GIẢI CAO BẰNG KỸ THUẬT NGS

26. XÉT NGHIỆM XÁC ĐỊNH HLA ĐỘ PHÂN GIẢI CAO BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN SANGER

27. XÉT NGHIỆM TỶ LỆ MỌC MẢNH GHÉP (CHIMERISM) VỚI MÁU TOÀN PHẦN BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR

28. XÉT NGHIỆM TỶ LỆ MỌC MẢNH GHÉP (CHIMERISM) THEO DÒNG TẾ BÀO BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR

29. XÉT NGHIỆM GEN VỚI ctDNA BẰNG KỸ THUẬT NGS

30. XÉT NGHIỆM LAI TẠI CHỖ GẮN MÀU (ISH)

31. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ PHÂN TỬ BẰNG KỸ THUẬT CISH

32. XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP

33. XÉT NGHIỆM CÁC GEN BẰNG KỸ THUẬT MLPA

34. XÉT NGHIỆM GIẢI TRÌNH TỰ GEN

35. XÉT NGHIỆM GIẢI TRÌNH TỰ ĐƠN GEN BẰNG KỸ THUẬT NGS

36. XÉT NGHIỆM GIẢI TRÌNH TỰ ĐA GEN BẰNG KỸ THUẬT NGS

37. XÉT NGHIỆM PHÂN MẢNH DNA TINH TRÙNG

PHỤ LỤC

DANH MỤC KỸ THUẬT

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

1. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ (KARYOTYPE) TẾ BÀO DỊCH ỐI; TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ; GAI RAU

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Xét nghiệm nhiễm sắc thể (Karyotype) để phát hiện các bất thường số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể (NST) phục vụ chẩn đoán, tiên lượng và điều trị bệnh di truyền/hội chứng bệnh.

Xét nghiệm nhiễm sắc thể từ tế bào dịch ối được chỉ định trong những trường hợp sau:

- Thai có nguy cơ cao mắc các bệnh, hội chứng liên quan đến các bất thường số lượng NST: hội chứng Down, hội chứng Patau, hội chứng Edwards

- Siêu âm thai có dị tật bẩm sinh nặng nề liên quan đến các bất thường cấu trúc NST lớn.

- Tiền sử gia đình có sinh con mang bất thường NST hoặc có bố hay mẹ là người mang chuyển đoạn NST dạng cân bằng.

Xét nghiệm nhiễm sắc thể tế bào gốc trung mô được thực hiện nhằm phát hiện các bất thường số lượng hay cấu trúc NST mục đích quyết định có lưu trữ, sử dụng để điều trị bệnh bằng mẫu tế bào gốc.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

1.2.1. Định nghĩa

Kỹ thuật công thức nhiễm sắc thể (Karyotype) là kỹ thuật di truyền dựa trên việc phân tích bộ NST trong 1 tế bào. So sánh bộ NST của người bệnh với bộ NST chuẩn của người về số lượng, kích thước, độ phân giải băng để đánh giá những bất thường số lượng NST dạng: đa bội, thiểu bội, lệch bội và các bất thường cấu trúc NST dạng: chuyển đoạn, mất đoạn, lặp đoạn, đảo đoạn, NST hình vòng, NST marker.

1.2.2. Nguyên lý

- Trong quá trình mang thai, các tế bào ở da, niêm mạc miệng, hệ thống tiêu hóa, tiết niệu của thai nhi bong ra giải phóng vào buồng ối. Do vậy, nuôi cấy dịch ối sẽ thu hoạch được dòng tế bào của thai nhi.

- Tế bào gốc trung mô là các tế bào gốc trưởng thành đa năng và có đặc tính sinh học đặc biệt. Các tế bào này có khả năng tăng sinh khi được nuôi cấy ngoài cơ thể và có khả năng biệt hóa thành các tế bào có chức năng trong cơ thể. Trong cơ thể tế bào gốc trung mô tồn tại ở nhiều cơ quan, bộ phận như: mô mỡ, tủy xương, nhau thai, dây rốn. Trong thực tế tế bào gốc trung mô thuộc loại tế bào bám dính (mesenchymal stem cell - MSC) sẽ dễ dàng nuôi cấy và có tính sinh miễn dịch yếu, do vậy ít kích thích phản ứng thải ghép hơn.

- Mẫu dịch ối, tế bào gốc trung mô được nuôi cấy với môi trường giàu dinh dưỡng, nuôi cấy trong thời gian 7-14 ngày. Mẫu bệnh phẩm được nuôi cấy trong chai nuôi cấy thành dòng tế bào, sau đó cấy chuyển sang đĩa petri với lamen làm giá đỡ. Sau nuôi cấy, tế bào được tiếp xúc với chất dừng nguyên phân khi đó sẽ thu được các NST ở kỳ giữa. NST lúc này giãn xoắn tối đa là giai đoạn tối ưu để quan sát hình thái, cấu trúc.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 02 người.

2.2. Vật tư

2.2.1. Dụng cụ

- Chai nuôi cấy có ống thông khí; chai thủy tinh (250mL, 500mL…); cốc thủy tinh; ống ly tâm nhọn (15mL).

- Pipet nhựa vô trùng (10mL, 3mL…); đầu côn có phin lọc (1000 µL, 200 µL…).

- Đĩa petri 35mm; Đĩa petri thủy tinh.

- Lam kính; Lamen phủ 22x22mm.

- Khay đựng ống các thể tích (15 mL…), khay đựng đĩa nuôi cấy.

2.2.2. Hóa chất/sinh phẩm

- Hóa chất dùng chung: nước cất 2 lần; 100% ethanol.

- Ống đựng bệnh phẩm (ống đựng mẫu vô trùng, chống đông heparine); găng tay; khẩu trang; mũ giấy; bông cồn; băng dính; văn phòng phẩm (giấy chỉ định, giấy hẹn trả kết quả xét nghiệm); sát khuẩn tay nhanh; quần áo nhân viên lấy mẫu.

- Hóa chất nuôi cấy:

+ Nuôi cấy tế bào dịch ối: sử dụng môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh là môi trường được bổ sung với FBS Bovine Serum (FBS), L-glutamine và PHA để tối ưu hóa sự bám dính và phát triển của tế bào.

+ Nuôi cấy tế bào gốc trung mô: sử dụng môi trường đặc hiệu (Stempro™ MSC SFM XenoFree…) phù hợp cho sự tăng trưởng và tăng sinh của tế bào trung mô người (MSCs) và tế bào gốc từ mô mỡ (Adipose-derived Stem cells (ADSCs) dạng bám dính. Với môi trường này tế bào MSCs của người có thể được phát triển qua nhiều lần cấy truyền mà vẫn giữ được khả năng biệt hóa thành 3 dòng khác nhau của tế bào trung mô (tế bào xương, sụn, mỡ). Thành phần không chứa Glutamine, kháng sinh, phenol Red.

- Hóa chất thu hoạch tế bào: Trypsin EDTA 1X; Colcemid; Acid acetic; Methanol; KCl;

- Hóa chất nhuộm băng G: PBS; đệm Phosphat (KH2PO4:Na2PO4); Giêmsa; Trypsin 2,5%; Glycerin; Ethanol tuyệt đối; hóa chất dùng để cố định lamen phủ trên tiêu bản, mục đích lưu giữ lam để kiểm tra lại kết quả phân tích khi cần (DPX moutant)…

- Hóa chất phân tích: dầu soi kính

2.3. Trang thiết bị

- Tủ an toàn sinh học cấp II, tủ nuôi cấy tế bào 37°C, 5% CO₂; tủ hút mùi hóa chất độc hại.

- Hệ thống kính hiển vi chụp và phân tích công thức nhiễm sắc thể tự động miễn dịch huỳnh quang, phần mềm phân tích NST Karyotyping.

- Kính hiển vi quang học; kính hiển vi soi ngược.

- Máy li tâm thường

- Pipet aid 5-50mL; Pipet (200 µL và 1000 µL…); Pipet Spenser (10 mL, 25 mL…)

- Tủ lạnh và tủ âm các loại (-20°C; -40°C; -80°C…).

- Thiết bị phụ trợ: máy lắc; tủ ổn nhiệt khô; bể ổn nhiệt nước; máy hút dịch, nồi khử trùng ướt; tủ sấy khô; cân điện tử; lưu điện; nhiệt ẩm kế; nhiệt kế; máy in ảnh.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Loại mẫu bệnh phẩm: dịch ối, tế bào gốc trung mô

- Tiêu chuẩn mẫu bệnh phẩm:

+ Dịch ối: thể tích 15-20 mL đựng trong ống đựng mẫu vô trùng.

+ Tế bào gốc trung mô: có thể lấy từ các nguồn như dịch tuỷ xương, mô mỡ, dây rốn, tế bào máu cuống rốn. Tuỳ thuộc mục đích sử dụng tế bào gốc trung mô để lấy lượng bệnh phẩm phù hợp, tiêu chuẩn lượng mẫu trung bình: 25x10⁶ tế bào/ 1mL môi trường nuôi cấy.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Kiểm tra phiếu chỉ định: kiểm tra thông tin theo quy định.

- Kiểm tra ống đựng bệnh phẩm: kiểm tra thông tin theo quy định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật

9 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Phòng xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử.

3. AN TOÀN

- Đảm bảo nguyên tắc an toàn sinh học.

- Đảm bảo an toàn theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Chuẩn bị chung các bước thực hiện xét nghiệm

+ Khay đựng mẫu nuôi cấy, khay chai nuôi cấy thu hoạch, bút các loại

+ Găng tay, cồn tuyệt đối và cồn 70°C, sát khuẩn tay nhanh, đăng kí sử dụng tủ an toàn sinh học, tủ ấm CO₂, máy li tâm, bể ổn nhiệt, tủ ấm.

+ Ghi tên người bệnh trên chai nuôi cấy theo quy định.

+ Hóa chất cần dùng cho mỗi lần thực hiện quy trình: đảm bảo số lượng, hạn sử dụng, điều kiện bảo quản.

+ Các biểu mẫu theo dõi thực hiện quy trình (nếu có).

4.1.1. Nuôi cấy tế bào

- Thực hiện tất cả các thao tác trong tủ an toàn sinh học cấp II. Ghi đầy đủ thông tin vào phiếu theo dõi sử dụng tủ an toàn sinh học cấp II

- Bật tủ theo đúng trình tự quy định, chạy khởi động trong 5 phút, vệ sinh bề mặt tủ an toàn sinh học bậc II bằng cồn 70°C, sau đó là dung dịch làm sạch và khử khuẩn bề mặt dùng trong y tế.

- Điền đầy đủ thông tin của người bệnh và kiểm tra chất lượng mẫu qua đánh giá thể tích, màu sắc dịch ối, máu cuống rốn, mô dây rốn (vẩn đục, có máu) vào trong phiếu theo dõi thực hành.

- Mỗi người bệnh sẽ có 1 hoặc 2 chai nuôi cấy tùy thuộc vào số lượng xét nghiệm đăng ký làm, viết nhãn có đủ tên, mã số người bệnh, tên bệnh và số thứ tự (nếu có) rồi dán và ngày làm thực hành lên mặt bên của chai nuôi cấy.

- Dịch ối: ly tâm ống đựng dịch ối ở tốc độ 1800 vòng/phút trong 5 phút. Bỏ phần dịch nổi, kiểm tra lại phần cặn tế bào. Cho 3mL môi trường nuôi cấy vào chai nuôi cấy và 1mL môi trường vào trong ống chứa cặn tế bào. Dùng pipet trộn đều cặn tế bào vào dung dịch. Chuyển toàn bộ phần dung dịch chứa cặn tế bào ối từ ống vào trong chai nuôi cấy, ghi mã số và giữ lại ống chứa cặn tế bào.

- Tế bào gốc trung mô: tùy loại tế bào là máu cuống rốn, mô dây rốn mà định lượng mẫu bệnh phẩm cho vào chai nuôi cấy, lượng mẫu trung bình là 25x10⁶ tế bào/1mL môi trường nuôi cấy.

- Dàn đều môi trường trên bề mặt chai nuôi cấy

- Kiểm tra chất lượng và mật độ tế bào bằng kính hiển vi soi ngược

- Đặt chai nuôi cấy vào trong tủ ấm, 5% CO₂, 37°C.

- Thay môi trường lần 1 sau 72-96h tùy vào tình trạng bám dính và phát triển của tế bào nuôi cấy qua kiểm tra dưới kính hiển vi soi ngược. Dịch nổi trong chai nuôi cấy sau khi hút ra sẽ được giữ trong ống lấy mẫu ban đầu ở ngăn mát tủ lạnh (khoảng 4°C) cho đến khi kết thúc xét nghiệm. Dịch nổi này có thể được sử dụng để nuôi cấy tiếp trong trường hợp cần thiết.

- Thay môi trường mỗi 72 - 96h.

- Kiểm tra sự phát triển của các cụm tế bào để quyết định thời điểm thu hoạch.

4.1.2. Thực hiện thu hoạch tế bào từ chai nuôi cấy

Thông thường thời điểm thu hoạch là sau 8-10 ngày nuôi cấy. Kiểm tra sự phát triển của tế bào dưới kính hiển vi soi ngược để quyết định việc thu hoạch.

- Chuẩn bị trước thu hoạch

+ Rã đông ống trypsin đã chia nhỏ ở 37°C (cần 3mL/chai nuôi cấy).

+ Rã đông môi trường nuôi cấy nếu cần thiết (cần 10 mL/chai nuôi cấy).

+ Bật đèn tím khử trùng tủ an toàn sinh học cấp II trong tối thiểu 15 phút

+ Chuẩn bị các dụng cụ cần thiết: 01 ống đong 100mL, 2-3 đĩa thủy tinh/người bệnh, 4-6 đĩa nhựa 35mm/người bệnh, panh kẹp, 4-6 lamen 22x22mm ngâm trong cồn tuyệt đối

- Hút hết dịch nổi bằng pipet Pasteur nhựa trong chai nuôi cấy và chuyển vào ống ly tâm vô trùng 15mL (có ghi tên, mã số người bệnh và số thứ tự chai nuôi cấy).

- Cho 1mL Trypsin EDTA 1x vào trong chai nuôi cấy để tráng hết bề mặt. Hút dịch nổi và chuyển vào ống ly tâm 15mL đựng dung dịch ở trên.

- Cho 2mL Trypsin EDTA 1x vào trong chai nuôi cấy, ủ ở 37°C trong 3 phút.

- Kiểm tra lượng tế bào đã tách khỏi bề mặt chai nuôi cấy dưới kính hiển vi soi ngược. Nếu vẫn còn nhiều tế bào bám dính, gõ nhẹ vào thành chai nuôi cấy hoặc dùng dụng cụ nạo tế bào (cell scraper) để tách nốt các tế bào còn trên bề mặt chai nuôi cấy.

- Hút hết dịch nổi trong chai nuôi cấy và chuyển sang ống dịch tế bào ở trên.

- Thêm 1,5mL môi trường nuôi cấy vào để tráng đều bề mặt chai nuôi cấy, và chuyển hết dịch nổi vào ống dịch tế bào ở trên.

- Ly tâm ống dịch tế bào ở 1800 vòng/phút trong 5 phút.

- Kiểm tra cặn tế bào, loại bỏ dịch nổi và thêm vào ống 5 mL PBS vô trùng, ly tâm ống dịch tế bào ở 1800 vòng/phút trong 5 phút. Lặp lại bươc này 2 lần.

-Kiểm tra cặn tế bào, loại bỏ phần dịch nổi đến 200µL để làm xét nghiệm di truyền phân tử nếu có.

4.1.3. Cấy chuyển tế bào từ chai nuôi cấy sang đĩa Petri và cấy lưu dòng tế bào

- Chuẩn bị các đĩa petri nhựa 35mm với lamen 22x22mm bên trong, ghi mã số, tên người bệnh, đánh số thứ tự các đĩa lên trên bề mặt đĩa. Thông thường sẽ nuôi cấy 4-6 đĩa/người bệnh.

- Thêm 2,5 - 3mL môi trường nuôi cấy vào ống cặn tế bào đã thu hoạch ở phần 4.1.3, trộn đều.

- Hút 500µL dịch tế bào dàn đều trên lamen 22x22mm trong đĩa đã chuẩn bị ở trên. Yêu cầu dịch tế bào dàn đều và không tràn ra ngoài lamen. Kiểm tra mật độ tế bào trên kính hiển vi soi ngược để điều chỉnh lượng tế bào nuôi cấy cho phù hợp ở các đĩa tiếp theo.

- Đặt 2 đĩa petri nhựa vào trong 1 đĩa petri thủy tinh và nuôi cấy trong tủ ấm 37°C, 5% CO2 từ 4 đến 6h.

- Số cặn còn lại cấy trở lại chai nuôi cấy vừa thu hoạch và bổ sung môi trường nuôi cấy đến 4mL. Chai nuôi cấy này được gọi là mẫu lưu dòng tế bào, được nuôi cấy trong 7 ngày. Trong thời gian này sẽ tiến hành các xét nghiệm được chỉ định. Sau 7 ngày, chai nuôi cấy lưu dòng tế bào sẽ được thu hoạch như phần 4.1.3, tế bào sau nuôi cấy được lưu dòng tế bào bằng cách trữ đông ở nhiệt độ -80°C để thực hiện các xét nghiệm khi cần.

- Kiểm tra trên kính hiển vi soi ngược, nếu các tế bào bám tốt, bổ sung 1mL môi trường nuôi cấy/đĩa, và để trở lại tủ ấm 37°C, 5% CO₂ qua đêm.

- Kiểm tra mật độ tế bào phù hợp và tiến hành thu hoạch

4.1.4. Thu hoạch Nhiễm sắc thể từ đĩa Petri

- Dùng bơm tiêm 1mL và kim tiêm phù hợp, nhỏ 2 giọt colcemid cho vào mỗi đĩa petri, lắc nhẹ nhàng, để lại trong tủ ấm 3h30 phút.

- Chuẩn bị hóa chất thu hoạch.

- Quá trình thu hoạch được tiến hành tại nhiệt độ phòng và nên trong tủ hút để tránh mùi của dung dịch CRNAoy:

+ Thêm 3mL KCl/đĩa và để trong 17 phút, hút bỏ hết dịch nổi.

+ Thêm 3mL KCL và để trong 20 phút.

+ Thêm 3mL CRNAoy và để trong 10 phút, hút bỏ hết dịch nổi.

+ Thêm 3mL dung dịch CRNAoy và để trong 20 phút, hút bỏ hết dịch nổi. Lặp lại thêm 2 lần và để lần lượt trong 15 phút và 10 phút.

+ Trong lúc thời gian giữa các bước, chuẩn bị 1 tiêu bản sạch/lamen và để khô, dán nhãn có ghi mã số và tên người bệnh.

+ Nhỏ 1 giọt dung dịch DPX lên tiêu bản, chuyển lamen từ đĩa petri lên trên tiêu bản.

+ Để khô trong điều kiện độ ẩm 80%, nhiệt độ 56°C.

+ Kiểm tra tiêu bản dưới kính hiển vi soi ngược.

+ Giữ tiêu bản ở 37°C trong 72h hoặc 60°C qua đêm.

4.1.5. Nhuộm băng

- Các bước thực hiện:

+ Nhúng tiêu bản vào cốc PBS trong bể ổn nhiệt 37°C.

+ Bước 1: nhúng tiêu bản vào cốc trypsin, thời gian trypsin là 10 giây.

+ Bước 2: rửa tiêu bản qua 2 cốc PBS ở nhiệt độ phòng.

+ Bước 3: ngâm tiêu bản trong dung dịch Giemsa nhuộm 9 phút.

+ Bước 4: rửa nhẹ dưới vòi nước và để khô.

+ Kiểm tra chất lượng băng dưới kính hiển vi.

Chất lượng băng đạt yêu cầu khi đủ 400 băng của thang điểm đánh giá độ phân giải của băng G theo tổ chức di truyền học lâm sàng.

* Nếu chất lượng băng chưa đạt yêu cầu cần tiến hành dò lại tiêu bản theo các bước từ 1-4 để xác định thời gian xử lý trypsin phù hợp. Nếu NST chưa cắt băng thì cần tăng thời gian xử lý trypsin lên 11 giây. Nếu NST bị cắt băng quá mức thì cần giảm thời gian xử lý trypsin xuống 9 giây.

* Nếu chất lượng băng đạt yêu cầu thì tiến hành nhuộm các tiêu bản còn lại theo các bước từ 1-4.

- Tiêu bản sau khi khô hoàn toàn được dán lamen 24x50 mm lên bề mặt bằng dung dịch DPX (nhỏ 2-3 giọt DPX lên bề mặt tiêu bán và phủ lamen lên trên, đuổi hết các bọt khí khỏi tiêu bản).

- Ghi vào phiếu theo dõi thực hiện nuôi cấy, thu hoạch và nhuộm tế bào.

4.1.6. Phân tích nhiễm sắc thể.

- Mỗi mỗi bệnh phẩm cần được đếm và phân tích 20 cụm nhiễm sắc thể, trong đó ít nhất 3 cụm nhiễm sắc thể được lập karyotype.

- Trong trường hợp có dòng tế bào khác: Phân tích ít nhất 30 cụm NST ở hai chai nuôi cấy độc lập.

- Không báo cáo kết quả với các trường hợp khảm thấp (nếu phân tích 30 cụm NST có thể không báo cáo trường hợp khảm <15%; nếu phân tích 50 cụm NST, có thể không báo cáo trường hợp khảm <9%).

4.2. Nhận định kết quả

- Xem xét kết quả: thực hiện nội kiểm chất lượng theo quy trình nội kiểm chất lượng.

- Đọc và nhận định kết quả: So sánh kết quả phân tích nhiễm sắc thể của người bệnh với bộ nhiễm sắc thể của người bình thường. Căn cứ vào số lượng, kích thước và độ phân giải băng của nhiễm sắc thể đưa ra được kết luận người bệnh có mang bất thường nhiễm sắc thể bất thường về số lượng hoặc cấu trúc.

- Sau khi hoàn thành phân tích, đưa ra kết luận về Karyotype, lựa chọn 1 cụm có chất lượng tốt nhất để báo cáo hình ảnh. Đối với các trường hợp thể khảm, in đủ số ảnh đại diện cho từng dòng tế bào. Yêu cầu về cụm NST làm báo cáo: các băng rõ ràng, các nhiễm sắc thể tách rời nhau, phản ánh đúng và trung thực kết quả bất thường.

- Báo cáo kết quả :Mỗi người bệnh sẽ gồm các trang kết quả: giấy chỉ định xét nghiệm (trang 1), báo cáo kết quả (trang 2) và báo cáo hình ảnh công thức nhiễm sắc thế (từ trang 3, 1 ảnh trong trường hợp kết quả Công thức NST dạng thuần, nhiều ảnh trong các trường hợp có bất thường NST dạng khảm).

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

4.3.1. Trả kết quả

- Báo cáo kết quả xét nghiệm được thực hiện theo các quy trình liên quan, lưu hồ sơ và ghi vào biểu mẫu cần thiết và lưu hồ sơ xét nghiệm.

- Kết quả xét nghiệm cần được kiểm tra chéo, phê duyệt trước khi trả.

4.3.2. Lưu trữ hồ sơ

Hồ sơ xét nghiệm được lưu trữ theo quy định.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

- Các chất ảnh hưởng đến xét nghiệm (yếu tố nhiễu) và các phản ứng chéo, các chất ảnh hưởng đến xét nghiệm: ống đựng mẫu cần vô trùng.

- Nhầm mẫu bệnh phẩm: lấy lại mẫu bệnh phẩm của người bệnh.

5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật

- Nhân viên không tuân thủ quy trình kỹ thuật: thực hiện lại quy trình kỹ thuật.

- Hóa chất hết hạn sử dụng và không được bảo quản đúng quy định của nhà sản xuất hoặc không được trộn đều trước khi chia sang các ống nhỏ hoặc trước khi hút: thay hóa chất mới.

- Nhiễm trùng: lấy lại mẫu, và tiến hành lại quy trình kỹ thuật.

5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật

- Nhầm mẫu bệnh phẩm: lấy lại mẫu bệnh phẩm của người bệnh.

- Thực hiện sai quy trình kỹ thuật: tiến hành lại xét nghiệm.

- Phân tích kết quả không chính xác: kiểm tra và phân tích chéo kết quả xét nghiệm hoặc xin ý kiến của bác sĩ lâm sàng.

- Mẫu chứng nội kiểm không có kết quả: cấy lại hoặc thay mẫu chứng khác.

- Báo cáo sai kết quả xét nghiệm: thông báo tới lãnh đạo khoa xét nghiệm và sửa lại kết quả xét nghiệm.

- Lựa chọn sai biểu mẫu báo cáo kết quả: báo cáo lãnh đạo khoa và sửa lại báo cáo kết quả.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

6.1. Nuôi cấy tế bào

- Mật độ tế bào đạt ≥ 70%, nhiều tế bào kì giữa tròn sáng.

6.2. Thu hoạch tế bào sau nuôi cấy

- Chất lượng tế bào dịch ối hoặc tế bào gốc trung mô sau nuôi cấy đạt tiêu chuẩn thu hoạch khi soi trên kính hiển vi soi ngược quan sát được trên bề mặt chai nuôi cấy có 4-5 clone tế bào bám dính.

Số lượng cụm tế bào ≥ 10 tế bào/ 1 vi trường

6.3. Nhuộm băng G

- Chất lượng băng NST đạt tiêu chuẩn theo quy định: đảm bảo số lượng bặng 400-500 băng.

6.4. Phân tích nhiễm sắc thể

Hai nhân viên được đào tạo, có chứng chỉ chuyên môn, phân tích độc lập.

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Jean McGowan-Jordan, Ottawa, ON Ros J. Hastings.2020. An international system for human cytogenomic nomenclature (ISCN). Karger.

2. Marilyn S Arsham, Margaret J Barch, and Helen J. Lawce; The AGT cytogenetics laboratory manual; 4; The organization for cytogenetics and molecular professionals; Chromosome stain, 235-238.

3. Leversha M, Sinfield C and Webb G; Rapid and reliable methods for the G and C banding of Human Chromosomes; Aust J Med Lab Sci 1; 139-143

4. Mireille Claustres1, Viktor Kozˇich2, Els Dequeker3 et al. 2014. Recommendations for reporting results of diagnostic genetic testing. European Journal of Human Genetics 22, 160-170

5. Trần Đức Phấn, Lương Thị Lan Anh và cs. 2021. Di truyền y học. Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam.

Phụ lục: Hướng dẫn lập Karyotype theo danh pháp quốc tế

- Nhận định bộ NST người:

Bộ nhiễm sắc thể của người bình thường bao gồm 22 cặp NST thường và 1 cặp NST giới tính với karyotype được viết dưới dạng: 46,XX ở người nữ hoặc 46,XY ở người nam. 46 NST người được xếp thành 7 nhóm, ký hiệu là A, B, C, D, E, F và G, theo vị trí của phần tâm.

Hình 1: Công thức nhiễm sắc thể của người nam bình thường

Nhóm A (NST 1,2,3): kích thước lớn nhất, cặp số 1: tâm giữa, cặp số 2: tâm lệch, cặp số 3: tâm giữa.

Nhóm B (NST 4,5): kích thước lớn và tương đồng về chiều dài và đều có tâm lệch.

Nhóm C có 7 cặp NST, bao gồm từ số 6 đến số 12: có kích thước trung bình, tâm lệch. NST X cũng được xếp vào nhóm này.

Nhóm D có 3 cặp NST số 13, 14 và 15 : kích thước trung bình, đều là NST tâm đầu, có vệ tinh gắn vào cánh ngắn.

Nhóm E có 3 cặp NST số 16, 17 và 18, các NST này tương đối ngắn. NST số 16 có tâm giữa, còn cặp số 17 và 18 có tâm lệch.

Nhóm F có 2 cặp NST số 19 và số 20: kích thước ngắn, tâm giữa.

Nhóm G có 2 cặp NST số 21 và số 22: kích thước ngắn, tâm đầu và có vệ tinh.

NST Y cũng được xếp vào nhóm này, tuy nhiên NST Y không có vệ tinh.

- Thang điểm đánh giá độ phân giải băng G

Theo tổ chức di truyền học lâm sàng. Cụm NST có thể phân tích cần đảm bảo tối thiểu 400 băng theo tiêu chuẩn của tổ chức di truyền học lâm sàng.

Bảng 1: Thang điểm đánh giá độ phân giải của băng G theo tổ chức di truyền học lâm sàng

- Cách viết danh pháp quốc tế

+ Danh pháp quốc tế của các bất thường số lượng, bất thường cấu trúc và đa hình được viết đúng chuẩn của ISCN (An international system for human cytogenomic nomenclature).

+ Công thức nhiễm sắc thể được ghi như sau: [tổng số nhiễm sắc thể], [nhiễm sắc thể giới], [bất thường nhiễm sắc thể]. Nhiễm sắc thể thường chỉ được ghi khi có bất thường.

+ Ví dụ: 46,XX: Bộ NST nữ bình thường; 46,XY: Bộ NST nam bình thường

+ Bất thường số lượng NST dùng dấu + (tăng) hoặc - (giảm) viết trước NST để chỉ sự thay đổi số lượng NST, ví dụ: 47,XX,+21.

+ Bất thường số lượng NST giới được ghi như sau:

45,X: Bộ NST chỉ có 1 NST X (hội chứng Turner)

47,XXY: Bộ NST có 2 NST X và 1 NST Y ( Hội chứng Klinefelter)

47,XYY: Bộ NST có 1 NST X và 2 NST Y

48,XXXY: Bộ NST có 3 NST X và 1 NST Y

+ Trong các bất thường NST thì NST giới bất thường được ghi đầu tiên, tiếp theo là các bất thường NST thường sắp xếp theo thứ tự NST từ 1->22, các bất thường viết cách nhau bằng dấu phẩy (,). Ví dụ: 47,X,i(X)(q10),+21.

Bảng 2: Một số kí hiệu thường dùng trong bất thường cấu trúc NST:

2. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ BẰNG KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG HUỲNH QUANG (QF-PCR)

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Xét nghiệm QF-PCR dùng để phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể ở các cặp NST 13, 18, 21, X, Y…

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

QF-PCR là viết tắt PCR huỳnh quang định lượng. QF-PCR sử dụng kỹ thuật PCR khuếch đại đăc hiệu các đoạn DNA lặp lại ngắn (Short tandem repeat-STR) nằm trên các NST cần khảo sát. Các đoạn STR này được khuyếch đại, gắn mồi huỳnh quang, sẽ tạo ra các sản phẩm PCR huỳnh quang khác nhau và được định lượng bằng điện di mao quản; kết quả được hiển thị thông qua các đỉnh (peak) trên hệ thống máy quét tự động.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 01 người.

2.2. Vật tư

- Hóa chất dùng để tách chiết DNA: có thể dùng các phương pháp tách DNA khác nhau đạt tiêu chuẩn như dùng chelex, cột lọc, tự động hoặc thủ công.

- Hóa chất dùng cho phản ứng QF - PCR:

• Đoạn mồi huỳnh quang (primer).

• DNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).

• Taq DNA polymerase.

• Đệm thích hợp.

- Hóa chất điện di huỳnh quang: Hi - Di^TM Formamide, Size Standard, gel điện di, Buffer.

- Ống ly tâm 1,5mL.

- Pipet định mức, đầu côn các loại, ống PCR, găng tay, giấy thấm.

- Bơm tiêm, đèn cồn, nhãn dán.

2.3. Trang thiết bị

- Buồng cấy vô trùng;

- Máy Vortex;

- Máy ly tâm, máy ly tâm lạnh, tủ lạnh sâu…;

- Máy nhân gen PCR;

- Hệ thống giải trình tự gen (ví dụ: ABI 3500 hoặc hệ thống máy có thể thực hiện được xét nghiệm này).

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Đối với mẫu dịch ối: 10-15mL dịch ối được lấy vô trùng trong phòng thủ thuật, đựng trong 2 ống ly tâm 15mL vô trùng được vận chuyển về phòng xét nghiệm. Chất lượng mẫu: dịch ối trong, có màu vàng chanh và không lẫn máu.

- Đối với mẫu máu ngoại vi: 1-2 mL máu ngoại vi được lấy và bảo quản trong ống vô trùng chứa chất chống đông EDTA.

- Kiểm tra đối chiếu tên, tuổi, địa chỉ, tuổi thai, chỉ định và ngày chọc ối trên tuýp dịch ối với hồ sơ người bệnh, gắn mã số bệnh phẩm theo mã số của phòng xét nghiệm.

- Mẫu được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ phòng 25°C không quá 24 giờ.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật

8 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Phòng xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử.

3. AN TOÀN

- Sử dụng trang thiết bị bảo hộ cá nhân: găng tay, áo blouse, khẩu trang khi thực hiện xét nghiệm.

- Tuân thủ các nguyên tắc an toàn sinh học phòng xét nghiệm.

- Các thao tác trong quy trình cần đảm bảo vô trùng.

- Không để hóa chất tiếp xúc với da, mắt. Trong trường hợp tiếp xúc với mắt, rửa ngay mắt với nước sạch và tìm tư vấn y tế.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

Bước 1: Tách chiết DNA bằng phương pháp Chelex (có thể dùng các phương pháp khác tương đương)

- Lấy 1500µL dịch ối vào ống ly tâm 1,5 mL, ly tâm dịch ối ở 13.000 vòng/phút trong 3 phút. Giữ cặn.

- Đối với mẫu máu ngoại vi, lấy 200 µL vào ống ly tâm 1,5 mL.

- Lấy Chelex để ở nhiệt độ phòng 5 phút (dùng máy khuấy từ làm tan Chelex).

- Cho 30µL Chelex vào mỗi mẫu, vortex.

- Cho mẫu vào máy chạy PCR để tách DNA theo chương trình DNA prep.

- Sau khi PCR, vortex mẫu và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút.

Bước 2: Chạy PCR bằng các cặp mồi huỳnh quang

- Chuẩn bị Mastermix PCR.

• 7µL S1 + 3µL pcrmix + 5µL DNA.

• 7µL S2 + 3µL pcrmix + 5µL DNA.

- Chạy PCR theo chương trình tương ứng.

- Sau khi chạy PCR, vortex mẫu và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút.

Bước 3: Điện di sản phẩm PCR trên máy đọc trình tự tự động:

- Chuẩn bị Mastermix: 15µL Formamide tinh khiết + 0,3µL size standard

+ 1µL sản phẩm PCR (S1+S2).

- Chạy PCR biến tính DNA theo chương trình Denature trong 2 phút ở 96°C.

- Thiết lập chương trình chạy máy Điện di mao quản.

4.2. Nhận định kết quả

- Ngưỡng tối đa của cương độ tín hiệu huỳnh quang các peak để phân tích là <= 6000 RFU

Ngưỡng tối thiểu của cương độ tín hiệu huỳnh quang các peak: >= 200 RFU.

- Các trường hợp bình thường thấy được 2 alen thông qua hình ảnh 2 đỉnh (peak) với tỷ lệ 1:1 và xuất hiện ở ít nhất 2 marker đối với từng NST.

- Các mẫu trisomy sẽ tạo ra kiểu 3 alen hay 2 alen không cân xứng các marker trên NST tương ứng. Việc chẩn đoán trisomy được chấp nhận khi có ít nhất 2 marker ở trên cùng một NST có dạng 3 alen hay 2 alen không cân xứng và các marker còn lại của NST quan tâm ở trạng thái không kết luận.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

- In phiếu trả kết quả bằng phần mềm.

- Sao lưu kết quả và lưu trữ.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Cường độ tín hiệu huỳnh quang các peak vượt ngưỡng tối đa: cần pha loãng nồng độ DNA đầu vào PCR mix.

- Cường độ tín hiệu huỳnh quang các peak dưới ngưỡng tối thiểu: cần tăng nồng độ DNA đầu vào PCR mix.

- Các mẫu không đủ 2 marker bình thường hoặc bất thường trở lên không đủ điều kiện trả kết quả; các trường hợp nghi ngờ (các marker chỉ lên 1 đỉnh, nhiễu...) đều cho chạy lại bằng extra marker hoặc chạy lại mẫu.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện kiểm tra hoạt động của máy định kỳ theo quy trình của hãng.

- Hoá chất còn hạn sử dụng và được bảo quản theo hướng dẫn trên kit.

- Kết quả kiểm tra chất lượng, đánh giá theo Quy trình đảm bảo chất lượng xét nghiệm.

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Quyết định 5530/QĐ- BYT ngày 25/2/2015 của Bộ trưởng Bộ Y Tế, hướng dẫn xây dựng quy trình thực hành chuẩn trong quản lý chất lượng xét nghiệm tại cơ sở khám bệnh, chữa bệnh.

2. Hướng dẫn sử dụng hệ thống giải trình tự gen ABI 3130.

3. Quy trình xét nghiệm của bộ kit xét nghiệm Aneufast QF.

4. Badenas C. et al (2010): Assessment of QF-PCR as the First Approach in Prenatal Diagnosis. Journal of Molecular Diagnosis. 12 (6), 828-834.

5. Mann K., Ogilvie C.M. (2012): QF-PCR: application, overview and review of the literature. Prenatal Diagnosis 2012. 32, 309-314.

6. Faas, B.H.,Cirigliano, V. (2011): Rapid methods for targeted prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies. in Seminars in Fetal and Neonatal Medicine, 81-87.

7. Moftah, R., Marzouk, S., El-Kaffash, D., Varon, R., Bommer, C., Karbasiyan, M., et al. (2013): QF-PCR as a molecular-based method for autosomal aneuploidies detection. Advances in Reproductive Sciences. 1 (03), 21.

3. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ BẰNG KỸ THUẬT BOBS

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích

Phát hiện các lệch bội của nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X và Y, và các bất thường cấu trúc của các vùng nhiễm sắc thể liên quan đến các hội chứng vi mất đoạn. Xét nghiệm này được sử dụng để phát hiện các thêm hoặc mất nhiễm sắc thể trong các vùng nhiễm sắc thể liên quan tới 9 hội chứng vi mất đoạn (microdeletion syndromes) và các lệch bội nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X và Y của mẫu bệnh phẩm máu ngoại vi, dịch ối,.. trên hệ thống thiết bị đo huỳnh quang (Luminex 100/200,…).

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Việc phân tích được dựa trên công nghệ BACs-on-Beads, sử dụng các hạt huỳnh quang Luminex được gắn các đầu dò DNA (được tạo từ nhiễm sắc thể người cấy trên vi khuẩn - bacterial artificial chromosomes). 5 đầu dò khác nhau được sử dụng cho mỗi nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X và Y cùng với 4 tới 8 đầu dò khác nhau cho mỗi vùng liên quan tới vi mất đoạn. Sau đó thực hiện quá trình lai của mẫu đã được gắn nhãn và DNA chứng vào các đầu dò được thiết kế trên hạt BoBs. DNA của mẫu thực được thực hiện đơn. Các DNA chứng được thực hiện đôi. Sau khi quá trình lai kết thúc, tín hiệu được đọc với hệ thống thiết bị Luminex 100/200 cùng phần mềm xPONENT 3.1. Phần mềm phân tích kết quả BoBsoft lấy thông số tín hiệu từ Luminex 100/200 và so sánh cường độ tín hiệu giữa mẫu thực và mẫu chứng, từ đó nhận định về tình trạng nhiễm sắc thể trong vùng thiết kế.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 01 người.

2.2. Vật tư, hóa chất

- Hóa chất xét nghiệm Prenatal BoBs (hoặc bộ kit tương đương)

+ Hộp P1: bảo quản tại -30°C tới -16°C.

+ Hộp P2: bảo quản tại 2 - 8 °C.

+ Sau khi mở, các thành phần của hóa chất trong hộp P1 ổn định trong 4 tuần với 8 vòng rã đông/đông lạnh.

+ Sau khi mở, các thành phần của hóa chất trong hộp P2 ổn định trong 4 tuần tại điều kiện bảo quản.

- DNA chứng nam, DNA chứng nữ.

- Dung môi PBS, nước khử Ion.

- 70% Ethanol, 100% Ethanol.

- Hóa chất tách chiết DNA.

2.3. Trang thiết bị

- Hệ thống Luminex200 (hoặc hệ thống tương đương).

- Ống lấy mẫu vô trùng 15mL.

- Chai nuôi cấy vô trùng 25mL.

- Ống ly tâm 1,5mL.

- Ống PCR 0,2mL.

- Máy Vortex.

- Buồng cấy vô trùng, bơm tiêm, nhãn dán.

- Máy ly tâm lạnh, tủ lạnh.

- Máy nhân gen PCR.

- Đĩa tinh sạch 96 giếng, đĩa PCR 96 giếng, dải nắp ống cho đĩa, đĩa lọc hút chân không.

- Máng đựng hóa chất, tấm dán nhựa bảo vệ các đĩa.

- Pippet, pippet đa kênh các thể tích.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Đối với mẫu dịch ối: 10-15mL dịch ối được lấy vô trùng trong phòng thủ thuật, đựng trong 2 ống ly tâm 15mL vô trùng được vận chuyển về phòng xét nghiệm. Chất lượng mẫu: dịch ối trong, có màu vàng chanh và không lẫn máu.

- Đối với mẫu máu ngoại vi: 1-2 mL máu ngoại vi được lấy và bảo quản trong ống vô trùng chứa chất chống đông EDTA.

- Kiểm tra đối chiếu tên, tuổi, địa chỉ, tuổi thai, chỉ định và ngày chọc ối trên tuýp dịch ối với hồ sơ người bệnh, gắn mã số bệnh phẩm theo mã số của phòng xét nghiệm.

- Mẫu được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ phòng 25°C không quá 24 giờ

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật

36 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Phòng xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử.

3. AN TOÀN

- Đi găng tay, mặc áo blouse, đeo khẩu trang khi thực hiện xét nghiệm.

- Tuân thủ các nguyên tắc an toàn sinh học phòng xét nghiệm.

- Các thao tác trong quy trình nuôi cấy cần đảm bảo vô trùng.

- Không để hóa chất tiếp xúc với da, mắt.

- Đảm bảo như nhiệt độ, độ ẩm, môi trường không nhiễm khuẩn.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tách chiết DNA

Bước 1: Gắn nhãn DNA: thực hiện với việc sử dụng enzyme để kết nối các nucleotide đã được gắn biotin.

Bước 2: Tinh sạch DNA đã được gắn nhãn: sử dụng hóa chất tinh sạch cho sản phẩm PCR.

Bước 3: Lai DNA: sản phẩm DNA đã được gắn nhãn được lai với các hạt Beads.

Bước 4: Rửa sản phẩm và gắn các phân tử huỳnh quang báo cáo.

Bước 5: Sử dụng máy phân tích và đọc tín hiệu huỳnh quang tương thích.

Lưu ý: Đưa các hóa chất ra khỏi tủ âm sâu và để các hóa chất tại nhiệt độ phòng từ 15 - 30 phút trước khi sử dụng. Đảm bảo các hóa chất đã được rã đông trước khi sử dụng:

- Mẫu DNA đã tinh sạch.

- Random Primer Solution.

- Biotin-dNTP Mix.

- Polymerase.

 Lưu ý: Đưa các hóa chất từ tủ lạnh (2 - 8 °C) và để các hóa chất tại nhiệt độ phòng từ 15 - 30 phút trước khi sử dụng:

- Sample Diluent.

- DNA chứng (nữ).

- DNA chứng (nam).

Trước khi sử dụng, lắc (vortex) đều và ly tâm nhanh (spin down) các mẫu DNA cần xét nghiệm, mẫu DNA chứng và các hóa chất sử dụng (NGOẠI TRỪ POLYMERASE). Để các hóa chất tại nhiệt độ phòng để đảm bảo độ hòa tan và trộn tối đa.

Mẫu DNA

- Nồng độ DNA yêu cầu tối thiểu đạt trên 2,1ng/µL, độ tinh sạch OD 260/260mm từ 1,8 - 2,2, với những mẫu DNA có nồng độ trên 10ng/µL cần được pha loãng để nồng độ DNA trên tổng thể tích đạt trong khoảng 50 - 250ng trong tổng thể tích 24ul.

- Xét nghiệm đã được kiểm chứng với lượng mẫu DNA đầu vào từ 50 - 250ng với tổng thể tích 24µL.

- DNA sau khi được tách và tinh sạch có thể được bảo quản trong môi trường Tris-EDTA (pH 7,2) tại 2 - 8°C trong 1 năm, tại -20°C trong vòng 2 năm, và tại -70°C cho ít nhất 7 năm.

Bước 1: Ghi nhãn DNA (Labeling of Genomic DNA)

- Việc ghi nhãn có thể được thực hiện sử dụng đĩa PCR hoặc ống PCR 250µL hoặc dải ống PCR.

- Chuẩn bị 2 phản ứng cho mỗi DNA chứng. Chuyển 50ng DNA chứng nam và chứng nữ vào ống tương đương. Thêm dung dịch Sample Diluent để đưa thể tích từng ống tới 24µL.

- Chuẩn bị 1 phản ứng cho mỗi DNA thực. Chuyển 24µL DNA mẫu thực vào ống nếu DNA đầu vào trong khoảng 2,1 - 10ng/µL. Thêm Sample Diluent để pha loãng và đưa thể tích từng ống tới 24µL nếu nồng độ DNA đầu vào lớn hơn 10ng/µL.

Ghi chú: 24 µL là thể tích bắt buộc cho từng ống mẫu. Các mẫu DNA đầu vào với nồng độ <2,1ng/µL không đủ chất lượng và số lượng để làm xét nghiệm.

- Vortex và spin down ống chứa dung dịch Random Primer Solution, sau đó thêm 20µL dung dịch này vào từng ống mẫu. Vortex các ống 30 giây và spin down.

Ghi chú: Tổng thể tích của ống mẫu tại thời điểm này là: 24µL (DNA mẫu trong Sample Diluent) + 20µL (Random Primer Solution) = 44µL.

- Đóng chặt các nắp ống và đưa các ống vào máy nhân gen PCR (PCR thermal cycler). Biến tính tại 98°C trong 5 phút, và hạ nhiệt tới 37°C. Thực hiện bước tiếp theo ngay khi máy PCR đạt 37°C.

- Chuẩn bị dung dịch ghi nhãn (Labeling Mix) trong ống 1,5mL. Vortex Biotin-dNTP Mix (NGOẠI TRỪ POLYMERASE - có thể dùng tay búng nhẹ vài lần vào ống) và ly tâm nhẹ (spin down) cả hai ống. Thể tích được tính toán thừa để bù trừ cho lỗi hút. Hút lên xuống 5 - 10 lần dung dịch Labeling Mix và spin down trước khi sử dụng:

Bảng 1. Thể tích các hóa chất dùng cho ghi nhãn AND (gắn Biotin)

- Hút 6µL của Labeling Mix vào từng ống mẫu. Dùng pipet để hút lên xuống dung dịch trong ống ít nhất 5 lần và ly tâm nhanh (spin down).

- Đóng chặt các nắp ống và ủ các ống mẫu trong máy PCR tại 37°C trong vòng 60 - 90 phút. Đưa các hóa chất trở về điều kiện bảo quản sau bước này.

- Trong lúc chờ đợi phản ứng PCR kết thúc, chuẩn bị cho bước tiếp theo (Tinh sạch sản phẩm DNA ghi nhãn). Khi chương trình PCR kết thúc, đưa các ống mẫu khỏi máy PCR.

Ghi chú: Nếu như bước tinh sạch chưa thể thực hiện ngay, bảo quản sản phẩm tại 4°C trong 6 tiếng hoặc -20°C qua đêm.

Bước 2: Tinh sạch sản phẩm DNA ghi nhãn (Purification of labeled DNA)

Sử dụng đĩa tinh sạch 96 giếng.

- Chuyển 50µL từ mỗi ống mẫu sang giếng tương đương sử dụng pipet thường hoặc đa kênh.

Ghi chú: Chuyển mẫu thật chậm trực tiếp lên màng (không chọc màng); tránh nhỏ mẫu vào thành giếng.

- Đặt đĩa tinh sạch lên bộ hút chân không. Áp dụng mức chân không khoảng 190 mmHg cho tới khi chất lỏng được hút hết hoàn toàn (khoảng 10 phút). Tắt máy hút chân không.

- Thêm 50µL dung môi TE (TE buffer) vào từng giếng. Áp dụng mức chân không khoảng 190mmHg cho tới khi chất lỏng được hút hết hoàn toàn (khoảng 10 phút). Tắt máy hút chân không.

- Thấm khô đáy các giếng của đĩa tinh sạch sử dụng giấy thấm.

- Thêm 25µL dung môi TE vào từng giếng trên đĩa.

- Đưa đĩa vào máy lắc ủ và lắc tại nhiệt độ phòng với tốc độ 1200 nhịp/phút trong 5 phút.

Chuyển 20µL của từng mẫu DNA vào ống PCR mới để pha loãng nếu cần thiết.

- Đo nồng độ DNA tinh sạch:

- Sử dụng máy quang phổ UV (Nanodrop) để đo nồng độ DNA của từng mẫu đã được ghi nhãn sau khi tinh sạch.

Ghi chú: DNA ghi nhãn sau khi tinh sạch có thể được bảo quản qua đêm tại nhiệt độ 2 - 8°C (không để quá lâu ảnh hưởng xấu đến kết quả). Nếu để qua đêm, lắc lại đĩa với máy lắc ủ trước khi sử dụng.

Bước 3: Lai DNA (DNA Hybridization)

- Đưa dung dịch lai Hybridization Buffer ra khỏi tủ âm sâu và BACs-on- Beads Mix từ tủ lạnh ra để thực hiện bước tiếp theo.

- Cài máy lắc ủ tới 52°C

- Pha loãng nồng độ DNA từ bước 2 xuống 200ng/µL nếu cần thiết (nếu nồng độ đo được >200ng/uL). Nếu nồng độ trong dải 150 - 200ng/µL, DNA có thể được sử dụng trực tiếp.

- Pha loãng: sử dụng dung môi TE để pha loãng:

Thể tích TE cần cho = ((nồng độ đo được/200) x 18,5) - 18,5 µL

- Tạo sơ đồ mẫu cho đĩa thực hiện bước ủ để các mẫu được đánh dấu với từng giếng.

- Sử dụng bảng sau để chuẩn bị Hybridization Mix cho bước lai ủ. Thể tích thừa đã được tính toán theo bảng sau:

Bảng 2. Thể tích các hóa chất cho xét nghiệm lai DNA

- Đảm bảo Hybridization Buffer đã đạt nhiệt độ phòng. Vortex 3 lần, mỗi lần 10 giây sau đó ly tâm nhanh (spin down).

- Hút lượng Hybridization Buffer cần thiết vào ống ly tâm 1,5mL

Ghi chú: Khi hút dung dịch Hybridization Buffer, lưu ý thao tác thật chậm vì độ nhớt của dung dịch này rất cao.

- Vortex BACs-on-Beads Mix 3 lần, mỗi lần 10 giây ngay trước khi dùng và hút lượng thể tích cần thiết vào ống Hybridization Mix.

- Ly tâm rất nhanh ống Hybridization Mix và vortex 3 lần, mỗi lần 10 giây.

- Chuyển 11µL của Hybridization Mix vào từng giếng đã được dựng trong sơ đồ.

Ghi chú: Thao tác hút rất chậm vì dung dịch có độ nhớt cao

- Chuyển 5uL của DNA mẫu đã được tinh sạch vào đáy mỗi giếng có chứa Hybridization Mix (sử dụng pipet thường hoặc đa kênh).

- Đậy nắp của đĩa cho các giếng với nắp thích hợp. Đảm bảo các nắp đã được đóng thật chặt.

- Chuyển đĩa mẫu ủ vào máy lắc ủ tại 52°C và lắc tại 800 vòng/phút trong 5 phút.

- Đặt đĩa vào máy PCR và biến tính tại 85°C trong 5 phút, và hạ nhiệt xuống tới 52°C.

- Khi máy PCR đã đạt 52°C, đưa đĩa khỏi máy PCR và một lần nữa đảm bảo các nắp trên đĩa đã được đóng thật chặt.

- Để đĩa rất nhanh vào máy lắc ủ tại 52°C và lắc tại 800 vòng/phút trong vòng 16 - 20 tiếng.

- Đảm bảo túi đá được chuẩn bị và được cho vào tử lạnh âm sâu - chuẩn bị cho bước hạ nhiệt máy lắc ủ trong bước 4.

Bước 4: Rửa DNA và gắn phân tử báo cáo (DNA Washing and Reporter binding)

- Bật máy để laser và hệ thống được khởi động ít nhất trước 30 phút trước khi sử dụng.

- Lấy dung dịch Wash Buffer 1 từ tủ lạnh.

- Tính toán lượng Wash Buffer 1 cần sử dụng. 125µL được cần cho mỗi giếng (thể tích thừa để bù trừ khi sử dụng pipet đa kênh).

- Lấy đĩa ủ lai từ máy lắc ủ (52°C) và ngay lập tức cài chế độ 50°C cho máy lắc ủ.

- Tháo các nắp giếng cẩn thận và nhẹ nhàng. Thêm 100µL của dung dịch Wash Buffer 1 vào từng giếng (dùng pipet đơn hoặc đa kênh). Hút nhanh lên xuống 10 lần liên tục để trộn dung dịch.

- Ủ đĩa tại 50°C và ở tốc độ lắc 1200 vòng/phút trong 20 phút.

- Chuẩn bị dụng cụ để hạ máy lắc ủ xuống 37°C.

- Trong lúc chờ đợi, lấy Reporter Concentrate, Reporter Diluent, và Wash Buffer 2 từ tủ lạnh và chuẩn bị Reporter Mix.

- Sử dụng bảng sau để tính toán lượng hóa chất cần thiết:

Bảng 3: Thể tích các hóa chất cho sửa AND và gắn phân tử báo cáo

- Pipet lượng thể tích cần thiết của Reporter Diluent vào ống thích hợp.

- Vortex Reporter Concentrate trong 5 giây, spin down và pipet lượng cần thiết vào ống Reporter Mix. Ngay lập tức, gói ống Reporter Mix vào giấy bạc để tránh ánh sáng.

- Vortex Reporter Mix 5 giây.

- Đĩa lọc 0,45um được sử dụng cho việc rửa và gắn phân tử Reporter. Tạo sơ đồ mẫu trên đĩa.

- Đậy lại các giếng chưa sử dụng trên đĩa lọc với miếng dãn đĩa bằng nhựa trong.

- Tính toán thể tích Wash Buffer 2 cần thiết. 0,47 mL cần cho mỗi giếng (thể tích thừa để bù trừ khi sử dụng pipet đa kênh đã được kết hợp).

- Thêm 30uL của Wash Buffer 2 vào các giếng sẽ sử dụng trên đĩa lọc để tao ẩm cho các giếng này. Không chạm màng của đĩa lọc.

- Lấy đĩa ủ lai ra khỏi máy lắc ủ (50°C). Ngay lập tức, cài đặt máy vào chế độ lắc tại 37°C. Đưa tấm đá trong tủ âm sâu vào máy lắc ủ, tháo các giá đỡ đĩa để hạ nhiệt máy xuống 37°C. Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch trong các giếng của đĩa ủ lai sang đĩa lọc đã được tạo ẩm.

- Sử dụng hệ hút chân không tại áp suất 125mmHg để hút dung dịch trong các giếng của đĩa ủ trong vòng khoảng 5 giây để chuyển toàn bộ dung dịch trong giếng và dừng lại ngay khi hết dung dịch.

- Thêm 100µL dung dịch rửa Wash Buffer 2 vào từng giếng. Không chạm màng lọc. Lặp lại bước rửa

- Cho thêm 100µL dung dịch rửa Wash Buffer 2 vào từng giếng. Không chạm màng lọc. Lặp lại bước rửa

- Lau khô đáy đĩa lọc bằng giấy thấm.

- Thêm 100µL của Reporter Mix vào từng giếng của đĩa lọc. Không chạm màng lọc.

Ghi chú: Đảm bảo máy lắc ủ đã đạt 37°C tại thời điểm này. Không đợi quá 15 phút giữ đĩa lọc tại nhiệt độ phòng và bảo về khỏi ánh sáng.

- Ủ đĩa lọc trong máy lắc ủ tại 37°C trong 30 phút.

- Sau bước ủ với Reporter Mix, sử dụng bộ hút chân không để loại bỏ dung dịch trên đĩa.

- Cho thêm 100µL của Wash Buffer 2 vào từng giếng. Lặp lại bước 4.18

- Lau khô đáy đĩa lọc bằng giấy thấm.

- Cho thêm 100µL của Wash Buffer 2 vào từng giếng. Không chạm màng lọc.

Ghi chú: Không hút chân không sau bước này. Đĩa lọc được chuyển và đọc với hệ thống đọc và phân tích tín hiệu huỳnh quang tương thích (Luminex 100/200…). Nếu như bước đo không được thực hiện ngay, gói đĩa trong giấy bạc để bảo vệ khỏi ánh sáng.

Bước 5: Đọc tín hiệu xét nghiệm

- Khởi động máy trước khi đọc tín hiệu. Hệ thống đã được thực hiện hiệu chuẩn và xác minh (calibration/verification) và đầu kim đã được điều chỉnh độ cao cho đĩa lọc.

- Mở protocol xét nghiệm.

- Đặt tên file xuất dữ liệu.

- Điền tên vào sơ đồ đĩa (F, M và mẫu thực…).

Ghi chú: Mẫu DNA chứng nam và nữ phải luôn được đặt tên tương đương là M và F.

- Đưa đĩa lọc vào máy, làm theo hướng dẫn và bắt đầu đọc tín hiệu.

- Sau khi đọc, chạy chu trình tắt máy theo hướng dẫn.

- Đổ bỏ các dung môi rửa Wash.

4.2. Nhận định kết quả

- Phân tích kết quả.

- Đánh giá kết quả: Các loại đột biến tương ứng với tỷ lệ tín hiệu huỳnh quang: Bình thường khi tỷ lệ từ 0,8 - < 1,3; mất đoạn khi tỷ lệ này < 0,8; nhân đoạn khi tỷ lệ > 1,3. Mất hoặc thêm đoạn của một vùng được chấp nhận khi có 3 đầu dò trở lên biểu hiện ngoài định mức cut-off của xét nghiệm.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

- In phiếu trả kết quả bằng phần mềm.

- Sao lưu kết quả và lưu trữ.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Chạy hiệu chuẩn theo quy định của hãng theo các mức ngày, tuần, tháng.

- Chạy kiểm tra cho mỗi Kit hóa chất mới

- Chạy kiểm tra sau khi tiến hành hiệu chuẩn hay thiết lập đường chuẩn mới.

- Kết quả kiểm tra chất lượng, đánh giá theo Quy trình đảm bảo chất lượng xét nghiệm

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Hướng dẫn sử dụng hệ thống Luminex200

2. Hướng dẫn sử dụng bộ Kit Prenatal BobS

3. Driscoll, D.A. and Gross S. (2009): Prenatal screening for aneuploidy. N. Engl. J. Med. 360 (24), 2556-2562.

4. Shaffer, L.G. (2001): Diagnosis of microdeletion syndromes by fluorescence in situ

5. Hybridization (FISH). Curr. Protoc. Hum. Genet. 8.10, 1-4.

6. Savva, G.M., Walker, K., and Morris, J.K. (2010): The maternal age- specific live birth prevalence of trisomies 13 and 18 compared to trisomy 21 (Down syndrome). Prenat. Diagn. 30, 57-64.

7. Clinical and Laboratory Standards Institute (2005): Collection, Transport, Preparation, and Storage of Specimens for Molecular Methods; Approved Guideline. CLSI Document MM13-A. CLSI, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, USA.

8. American College of Obstetricians and Gynecologists. ACOG Practice Bulletin No. 88, December 2007: invasive prenatal testing for aneuploidy. Obstet Gynecol. 2007; 110, 1459-1467.

4. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ TẾ BÀO ỐI, GAI RAU BẰNG KỸ THUẬT FISH

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Xét nghiệm nhiễm sắc thể tế bào dịch ối bằng kỹ thuật bằng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang (Flurorescence In situ Hibridization - FISH) để phát hiện một số bất thường số lượng, cấu trúc ở mức độ nhiễm sắc thể (NST) phục vụ chẩn đoán, tiên lượng và điều trị bệnh di truyền/hội chứng bệnh.

Kỹ thuật FISH từ tế bào ối thường được chỉ định trong các trường hợp sau:

- Thai có nguy cơ cao với các bệnh, hội chứng do bất thường số lượng NST: hội chứng Down, hội chứng Patau, hội chứng Edwards.

- Thai có nghi ngờ mắc các bệnh, hội chứng do bất thường cấu trúc NST dạng vi mất đoạn, lặp đoạn NST: hội chứng DiGeorge, hội chứng Prader Willi, hội chứng Williams, hội chứng lặp đoạn NST 22, lặp đoạn NST 15 hoặc các bất thường khác trên NST… Hoặc các trường hợp có nhu cầu cần làm xét nghiệm này.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

1.2.1. Định nghĩa

Kỹ thuật FISH là kỹ thuật di truyền dựa trên phân tích các tín hiệu huỳnh quang của các vùng NST, các gen, tổ hợp gen trong một tế bào. So sánh số lượng tín hiệu, màu sắc tín hiệu với tín hiệu trên tế bào bình thường theo quy định của hãng sản xuất các đầu dò. Từ đó đánh giá được bất thường số lượng NST dạng: đa bội, thiểu bội, lệch bội và các bất thường cấu trúc NST: mất đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn, khuếch đại.

1.2.2. Nguyên lý

Nguyên lý kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH (Fluorescent In-situ Hybridization) dựa trên nguyên tắc lai bổ sung giữa đầu dò huỳnh quang và trình tự DNA đích trong nhân tế bào. Các đầu dò huỳnh quang có kích thước từ 20 bp đến 1000 bp, đầu dò huỳnh quang có thể được đánh dấu vào vùng tận cùng của NST, tâm NST, các vùng gen đặc hiệu. Phân tích các tính hiệu huỳnh quang bằng hệ thống kính hiển vi huỳnh quang để phát hiện các dạng bất thường NST về số lượng và cấu trúc.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 01 người.

2.2. Vật tư

2.2.1. Dụng cụ

- Chai nuôi cấy có ống thông khí;

- Chai thủy tinh 250mL, 500mL;

- Cốc thủy tinh;

- Ống ly tâm nhọn 15mL;

- Pipet nhựa vô trùng 10mL, 3mL;

- Đầu côn có phin lọc 1000 µL, 200 µL, 10 µL;

- Đĩa petri 35mm;

- Đĩa petri thủy tinh;

- Lam kính SuperFrost hoặc xử lý polysine;

- Lamen phủ 22x22mm; 18x18mm;

- Khay đựng ống 2mL, 15 mL, khay đựng đĩa nuôi cấy.

2.2.2. Hóa chất/sinh phẩm

- Hóa chất dùng chung: nước cất 2 lần; 100% ethanol.

- Ống đựng mẫu vô trùng 15mL, găng tay; khẩu trang; mũ giấy; bông cồn; băng dính; văn phòng phẩm (giấy chỉ định, giấy hẹn trả kết quả xét nghiệm); giấy in tem, mực in tem; sát khuẩn tay nhanh; quần áo nhân viên lấy mẫu, nhân viên thực hiện xét nghiệm.

- Hóa chất nuôi cấy: sử dụng môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh là môi trường được bổ sung hóa chất cần thiết (Fetal Bovine Serum (FBS), L- glutamine và PHA…) để tối ưu hóa sự bám dính và phát triển của tế bào.

- Hóa chất thu hoạch tế bào: trypsin EDTA 1X, Colcemid, Acid acetic, Methanol, KCl

- Hóa chất lai: đầu dò huỳnh quang; thuốc nhuộm huỳnh quang (DAPI II couterstain…); dung dịch đệm lai; SSC 20x; NP 40.

- Hóa chất phân tích: dầu soi kính

2.3. Trang thiết bị

- Tủ an toàn sinh học cấp II; tủ nuôi cấy tế bào 37°C, 5% CO2; tủ hút mùi hóa chất độc hại;

- Tủ lạnh và tủ âm các loại (-20°C; -40°C; -80°C …).

- Hệ thống kính hiển vi chụp và phân tích công thức nhiễm sắc thể tự động miễn dịch huỳnh quang, phần mềm phân tích NST Karyotyping

- Kính hiển vi quang học; kính hiển vi soi ngược

- Máy li tâm thường; máy lai nhiệt.

- Pipet aid 5-50mL); Pipets (200 µL và 1000 µL…); Pipet Spenser (10 mL,25mL…).

- Thiết bị phụ trợ: máy lắc; tủ ổn nhiệt khô; bể ổn nhiệt nước; máy hút dịch, nồi khử trùng ướt; tủ sấy khô; cân điện tử; lưu điện; nhiệt ẩm kế; nhiệt kế.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Loại mẫu bệnh phẩm: tế bào dịch ối.

- Mẫu bệnh phẩm sử dụng có thể là cặn tế bào sau khi nuôi cấy hoặc sau khi thu hoạch trực tiếp.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Kiểm tra phiếu chỉ định: kiểm tra thông tin theo quy định.

- Kiểm tra ống đựng bệnh phẩm: Kiểm tra thông tin theo quy định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật

9 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Phòng xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử.

3. AN TOÀN

- Đảm bảo nguyên tắc an toàn sinh học.

- Đảm bảo an toàn theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Chuẩn bị chung các bước thực hiện xét nghiệm.

+ Khay đựng mẫu nuôi cấy.

+ Khay chai nuôi cấy thu hoạch.

+ Bút các loại.

+ Găng tay, cồn tuyệt đối và cồn 70°C, sát khuẩn tay nhanh, đăng kí sử dụng tủ an toàn sinh học, tủ ấm CO2, máy li tâm, bể ổn nhiệt, tủ ấm.

+ Hóa chất cần dùng cho mỗi lần thực hiện quy trình: đảm bảo số lượng, hạn sử dụng, điều kiện bảo quản.

+ Các biểu mẫu theo dõi thực hiện quy trình.

4.1.1. Nuôi cấy tế bào sử dụng cho kỹ thuật Metapahase FISH

- Thực hiện tất cả các thao tác trong tủ an toàn sinh học cấp II. Ghi đầy đủ thông tin vào phiếu theo dõi sử dụng tủ an toàn sinh học cấp II

- Bật tủ theo đúng trình tự quy định, chạy khởi động trong 5 phút, vệ sinh bề mặt tủ an toàn sinh học cấp II bằng cồn 70°C, sau đó là dung dịch làm sạch và khử khuẩn bề mặt dùng trong y tế.

- Điền đầy đủ thông tin của người bệnh và kiểm tra chất lượng mẫu vào trong phiếu theo dõi thực hành.

- Các bước thực hiện quy trình nuôi cấy các loại tế bào thực hiện theo quy trình “Xét nghiệm công thức Nhiễm sắc thể (Karyotype) tế bào dịch ối; tế bào gốc trung mô”.

4.1.2. Chuẩn bị mẫu tế bào sử dụng cho kỹ thuật Interphase FISH

- Chuẩn bị phiếu theo dõi thực hiện nuôi cấy, thu hoạch tế bào.

- Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm.

- Ghi nhãn mã số phòng xét nghiệm, tên người bệnh để dán ống đựng mẫu thu hoạch.

- Pha dung dịch nhược trương (KCl nồng độ 0,56g/mL).

- Làm ấm dung dịch Trypsin 1X.

- Pha dung dịch cố định tế bào (CRNAoy: 3 methanol/1 acid acetic).

- Chuẩn bị tiêu bản sạch.

- Các bước thực hiện:

+ Trước thu hoạch 30 phút:

* Làm ấm dung dịch Trypsin 1X (6 mL/mẫu) và KCl 0,075M (8 mL/mẫu) tại 37°C.

* Chuẩn bị tối thiểu 50 mL dung dịch CRNAoy.

+ Trộn đều và hút 200 mL mẫu máu ngoại vi sau xử lý trypsin ở bước trên chuyển vào ống ly tâm 15 mL, bổ sung 8 mL dung dịch KCl 0,075M đã làm ấm và ủ tại 37°C trong 30 phút.

+ Sau ủ, bổ sung 2 mL dung dịch CRNAoy để làm dừng quá trình nhược trương. Ly tâm 1800 vòng/phút, loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn.

+ Bổ sung 7 mL dung dịch CRNAoy, ly tâm 1800 vòng/phút, loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn. Lặp lại 2-3 lần.

+ Sau lần ly tâm cuối, loại bỏ dịch nổi đến 50 mL. Trộn đều cặn tế bào.

4.1.3. Tạo tiêu bản

- Chuẩn bị 1 tiêu bản có xử lý polysine cho 1 người bệnh, ghi nhãn tiêu bản (mã số PXN, tên người bệnh, đầu dò).

- Đánh dấu vùng lai bằng bút dạ đen và bút kim cương.

- Nhỏ 7-10 µL cặn tế bào sau thu hoạch theo chiều thẳng đứng vào vùng lai đã đánh dấu.

- Kiểm tra mật độ và chất lượng tế bào dưới kính hiển vi soi ngược. Nếu quan sát được từ 15-20 tế bào trong 1 vi trường thì vùng lai đạt tiêu chuẩn. Nếu mật độ tế bào ít hơn thì cần phun thêm cho đến khi đạt tiêu chuẩn. Nếu mật độ tế bào quá dày (~50 tế bào/ vi trường) thì cần pha loãng cặn tế bào (cho thêm dung dịch canroy vào cặn tế bào) và phun lại vùng lai khác.

4.1.4. Lai huỳnh quang a. Chuẩn bị:

- Ngâm 2 thanh ẩm vào nước trong 5 phút và lắp vào máy lai.

- Làm tan đầu dò và đệm ở nhiệt độ phòng, ly tâm nhanh 1-3 phút.

- Hai pipet: 01 pipet 0,5-2 µL và 01 pipet 10µL.

- Hai loại đầu côn có lọc 10 µL chống dính và không chống dính.

- Lamen 18x18 mm. b. Thực hiện:

- Chuẩn bị đầu dò: nhỏ lần lượt đầu dò và dung dịch đệm lên lamen 18x18 mm theo hướng dẫn của nhà sản xuất, trộn đều bằng pipet.

- Úp phần vùng tế bào đã đánh dấu trên tiêu bản vào lamen chứa hỗn hợp đầu dò, đuổi hết bong bóng (nếu có) và cố định lamen bằng keo cao su.

- Đặt tiêu bản vào máy lai nhiệt, chọn chu trình lai phù hợp.

4.1.5. Rửa sau lai

a. Chuẩn bị: Chuẩn bị 3 cốc nhựa hoặc thuỷ tinh chịu nhiệt:

+ Cốc 1: 100 mL dung dịch SSX 2X, bổ sung 300 µL NP40, để trong bể ổn nhiệt 75°C.

+ Cốc 2: 100 mL dung dịch SSX 2X, bổ sung 300 µL NP40, để ở nhiệt độ phòng.

+ Cốc 3: 100 mL nước cất, để ở nhiệt độ phòng.

+ Đồng hồ bấm giây.

+ Pipet 10 µL. b. Thực hiện:

- Tắt điện phòng, tránh ánh sáng trong quá trình rửa lam.

- Lấy tiêu bản ra khỏi máy lai, bóc keo cao su và loại bỏ lamen.

- Rửa tiêu bản trong coóng 1 tại 75°C trong 3 phút.

- Rửa tiếp tiêu bản trong coóng 2 tại nhiệt độ phòng trong 2 phút.

- Rửa nhanh tiêu bản trong vài giây ở coóng 3 và để tiêu bản khô tự nhiên tại nhiệt độ phòng.

+ Nhỏ 7 µL DAPI vào vùng tế bào lai đầu dò đã đánh dấu trên tiêu bản.

+ Phủ lamen 22x22 mm lên vùng đánh dấu, đuổi bọt khí và cố định lamen bằng sơn móng tay.

+ Cất tiêu bản vào khay và giữ trong ngăn đá tủ lạnh khoảng 2-3 phút đến khi phân tích kết quả.

4.1.6. Phân tích kết quả

- Phân tích trên kính hiển vi huỳnh quang được thực hiện độc lập bởi 2 kỹ thuật y.

- Tìm vi trường trên tiêu bản ở vật kính 10x với bộ lọc màu DAPI.

- Khi đã xác định được vi trường, chuyển sang vật kính dầu 100x, nhỏ dầu và dùng nút vi cấp lấy nét của vi trường ở độ phóng đại mới.

- Di chuyển tiêu bản theo một hướng nhất định (ví dụ: từ trái sang phải, từ trên xuống dưới). Khi thấy tế bào, quan sát các tín hiệu khác nhau bằng cách chuyển các bộ lọc, đếm số lượng tín hiệu quan sát được. Ghi số lượng tín hiệu vào phiếu phân tích kết quả FISH.

- Chụp lại hình ảnh tế bào bằng phần mềm phân tích tín hiệu huỳnh quang.

- Khi đã phân tích đủ số lượng, đưa ra kết luận cuối cùng và làm báo cáo trả kết quả.

4.2. Nhận định kết quả

- Xem xét mẫu nội kiểm chất lượng: mẫu nội kiểm trong tất cả các bước thực hiện quy trình đạt.

- Phân tích nhận định kết quả: so sánh số lượng, màu sắc, cách biểu hiển tín hiệu huỳnh quang với tín hiệu chuẩn của nhà sản xuất.

- Phiên giải và báo cáo kết quả: khi đã phân tích đủ số lượng, đưa ra kết luận người bệnh có mang các bất thường NST hay không.

- Nội dung báo cáo kết quả và lưu báo cáo theo quy định.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

4.3.1. Trả kết quả

- Báo cáo kết quả xét nghiệm được thực hiện theo các quy trình liên quan, lưu hồ sơ và ghi vào biểu mẫu cần thiết và lưu hồ sơ xét nghiệm.

- Kết quả xét nghiệm cần được kiểm tra chéo, phê duyệt trước khi trả.

4.3.2. Lưu trữ hồ sơ

Hồ sơ xét nghiệm được lưu trữ theo quy định.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

- Các chất ảnh hưởng đến xét nghiệm (yếu tố nhiễu) và các phản ứng chéo, các chất ảnh hưởng đến xét nghiệm: nhiễm tế bào mẹ trong dịch ối.

- Nhầm mẫu bệnh phẩm: lấy lại mẫu bệnh phẩm của người bệnh.

5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật

- Nhân viên không tuân thủ quy trình kỹ thuật: thực hiện lại quy trình kỹ thuật.

- Hóa chất hết hạn sử dụng và không được bảo quản đúng quy định của nhà sản xuất hoặc không được trộn đều trước khi chia sang các ống nhỏ hoặc trước khi hút.

- Nhiễm trùng: lấy lại mẫu, và tiến hành lại quy trình kỹ thuật.

5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật

- Nhầm mẫu bệnh phẩm: lấy lại mẫu bệnh phẩm của người bệnh.

- Thực hiện sai quy trình kỹ thuật: tiến hành lại xét nghiệm.

- Phân tích kết quả không chính xác: kiểm tra và phân tích chéo kết quả xét nghiệm hoặc xin ý kiến của bác sĩ lâm sàng.

- Mẫu chứng nội kiểm không có kết quả: cấy lại hoặc thay mẫu chứng khác.

- Báo cáo sai kết quả xét nghiệm: thông báo tới lãnh đạo khoa xét nghiệm và sửa lại kết quả xét nghiệm.

- Lựa chọn sai biểu mẫu báo cáo kết quả: báo cáo lãnh đạo khoa và sửa lại báo cáo kết quả.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

6.1. Nuôi cấy tế bào

- Thể tích môi trường, thể tích mẫu bệnh phẩm đảm bảo đúng theo quy trình.

- Chất lượng mẫu sau nuôi cấy được đánh giá bằng quan sát: môi trường trong, không vẩn đục, không thay đổi màu sắc, khi môi trường chuyển đục hay lẫn máu là những chai nuôi cấy có nguy cơ nhiễm trùng.

- Chai nuôi cấy nội kiểm không nhiễm trùng.

6.2. Thu hoạch tế bào sau nuôi cấy hoặc thu hoạch tế bào trực tiếp

- Chất lượng tế bào tế bào dịch ối sau nuôi cấy đạt tiêu chuẩn thu hoạch khi soi trên kính hiển vi soi ngược quan sát được trên bề mặt chai nuôi cấy có 4-5 clone tế bào bám dính.

- Giá trị báo động/nguy hiểm: nếu số lượng cụm tế bào NST <10 tế bào/vi trường thì tiêu bản không đạt chất lượng.

- Cách xử lý nếu chất lượng mẫu thu hoạch sau nuôi cấy hoặc hoặc thu hoạch trực tiếp: ly tâm lại cặn tế bào, tạo tiêu bản và kiểm tra lại hoặc thực hiện lại quy trình.

6.3. Lai huỳnh quang

- Chất lượng tín hiệu rõ ràng, đủ tiêu chuẩn nhận định

- Hóa chất được bảo quản theo các khuyến cáo của nhà sản xuất.

6.4. Phân tích tín hiệu huỳnh quang

- Tiêu chuẩn phân tích:

+ Mỗi người bệnh được phân tích bởi hai nhân viên độc lập

+ Tín hiệu huỳnh quang rõ ràng, sắc nét

+ Đảm bảo đủ số tế bào được phân tích, phù hợp với chỉ định của người bệnh.

- Đối với kỹ thuật Metaphase FISH: số lượng tế bào phân tích tối thiểu 10 tế bào, nếu phát hiện tình trạng khảm tăng số lượng tế bào phân tích là 30 tế bào.

- Đối với kỹ thuật Interphase FISH: số lượng tế bào phân tích tối thiểu là 50 tế bào, nếu phát hiện tình trạng khảm tăng số lượng tế bào phân tích là 100 tế bào.

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Jean McGowan-Jordan, Ottawa, ON Ros J. Hastings.2020. An international system for human cytogenomic nomenclature (ISCN). Karger

2. Marilyn S Arsham, Margaret J Barch, and Helen J. Lawce; The AGT cytogenetics laboratory manual; 4; The organization for cytogenetics and molecular professionals; Chromosome stain, 235-238

3. Leversha M, Sinfield C and Webb G; Rapid and reliable methods for the G and C banding of Human Chromosomes; Aust J Med Lab Sci 1; 139-143

4. Mireille Claustres1, Viktor Kozˇich2, Els Dequeker3 et al. 2014. Recommendations for reporting results of diagnostic genetic testing. European Journal of Human Genetics 22, 160-170

5. Trần Đức Phấn, Lương Thị Lan Anh và cs.2021. Di truyền y học. Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam.

5. XÉT NGHIỆM CÔNG THỨC NHIỄM SẮC THỂ (KARYOTYPE) TẾ BÀO MÁU NGOẠI VI; TỦY XƯƠNG; TẾ BÀO MÔ KHÁC

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Xét nghiệm nhiễm sắc thể (Karyotype) để phát hiện các bất thường số lượng hoặc cấu trúc nhiễm sắc thể (NST) phục vụ chẩn đoán, tiên lượng và điều trị bệnh.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

1.2.1. Định nghĩa

Kỹ thuật công thức nhiễm sắc thể (Karyotype) là kỹ thuật di truyền dựa trên việc phân tích bộ NST trong 1 tế bào. So sánh bộ NST của người bệnh với bộ NST chuẩn của người về số lượng, kích thước, độ phân giải băng để đánh giá những bất thường số lượng NST dạng: đa bội, thiểu bội, lệch bội và các bất thường cấu trúc NST dạng: chuyển đoạn, mất đoạn, lặp đoạn, đảo đoạn, NST hình vòng, NST marker.

1.2.2. Nguyên lý

Mẫu tế bào máu ngoại vi hoặc tủy xương được nuôi cấy với môi trường nuôi cấy phù hợp trong thời gian 24-72h. Đối với môi trường nuôi cấy tế bào máu ngoại vi có bổ sung PHA (phytohemagglutinin) gây tăng khả năng phân bào của tế bào Lympho T. Đối với mẫu bệnh phẩm tuỷ xương trong các bệnh lý tăng sinh ác tính tế bào tuỷ, bản chất là các tế bào non có sự tăng sinh mạnh mẽ nên trong môi trường nuôi cấy không cần bổ sung PHA. Sau nuôi cấy, tế bào được tiếp xúc với chất dừng nguyên phân khi đó sẽ thu được các NST ở kỳ giữa. NST lúc này giãn xoắn tối đa là giai đoạn tối ưu để quan sát hình thái, cấu trúc.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 02 người.

2.2. Vật tư

2.2.1. Dụng cụ

Chai nuôi cấy có ống thông khí; Chai thủy tinh 250mL, 500mL; Cốc thủy tinh; Ống ly tâm nhọn 15mL; Pipet nhựa vô trùng 10mL, 3mL; Đầu côn có phin lọc 1000 µL, 200 µL, 10 µL; Lam kính; Lamen phủ 24x50mm; khay đựng ống 2mL, 15 mL, khay đựng chai nuôi cấy.

2.2.2. Hóa chất/sinh phẩm

- Hóa chất dùng chung: nước cất 2 lần; 100% ethanol.

- Dụng cụ lấy mẫu: bơm tiêm 5 mL; ống đựng bệnh phẩm: ống chống đông Heparin, trang bị bảo hộ: găng tay; khẩu trang; mũ giấy; bông cồn; băng dính; văn phòng phẩm (giấy chỉ định, giấy hẹn trả kết quả xét nghiệm); sát khuẩn tay nhanh.

Hóa chất nuôi cấy:

+ Nuôi cấy tế bào máu ngoại vi: sử dụng môi trường được tối ưu hóa (bổ sung với Fetal Bovine Serum (FBS), L-glutamine và PHA…).

+ Nuôi cây tế bào tủy xương: sử dụng môi trường được tối ưu hóa (bổ sung với Fetal Bovine Serum (FBS), L-glutamine và PHA…).

- Hóa chất thu hoạch tế bào: colcemid, đối với tế bào tủy xương: có thể sử dụng thêm hóa chất cần thiết trong quá trình thu hoạch để tăng số lượng cụm NST và tăng độ phân giải của băng NST (Ethidium Bromide…), Acid acetic, Methanol, KCl.

- Hóa chất nhuộm băng G: PBS, đệm Phosphat (KH2PO4:Na2PO4), Giêmsa (pha 840 mL Glyxerin vào 10 g bột giemsa. Trộn đều trong 2 giờ, thêm 540 mL Methanol 100%, lọc và thu dung dịch Giemsa cần dùng), Trypsin 2,5%, Glycerin, Ethanol tuyệt đối, vật tư dùng để cố định lamen phủ trên tiêu bản, mục đích lưu giữ lam để kiểm tra lại kết quả phân tích khi cần (DPX moutant…), dầu soi kính.

2.3. Trang thiết bị

- Tủ an toàn sinh học cấp II; tủ nuôi cấy tế bào 37°C, 5% CO2; tủ hút hóa chất độc hại.

- Hệ thống kính hiển vi chụp và phân tích công thức nhiễm sắc thể tự động miễn dịch huỳnh quang, phần mềm phân tích NST Karyotyping; Kính hiển vi quang học; Kính hiển vi soi ngược.

- Máy li tâm (ống 15 mL 36 vị trí…).

- Pipet aid 5-50 mL; Pipets: 200 µL và 1000 µL; Pipet Spenser: 10 mL, 25 mL;

- Tủ lạnh và tủ âm các loại (-20°C; -40°C; -80°C…).

- Thiết bị phụ trợ: máy lắc; tủ ổn nhiệt khô; bể ổn nhiệt nước; máy hút dịch, nồi khử trùng ướt; tủ sấy khô; cân điện tử; lưu điện; nhiệt ẩm kế; nhiệt kế.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Loại mẫu bệnh phẩm: máu ngoại vi; dịch tủy xuong

- Tiêu chuẩn mẫu bệnh phẩm: thể tích 1,5-2 mL, đựng trong ống Heparin vô trùng.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Kiểm tra phiếu chỉ định: kiểm tra thông tin theo quy định.

- Kiểm tra ống đựng bệnh phẩm: kiểm tra thông tin theo quy định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật

9 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Phòng xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử.

3. AN TOÀN

- Đảm bảo nguyên tắc an toàn sinh học.

- Đảm bảo an toàn theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Chuẩn bị chung các bước thực hiện xét nghiệm

+ Khay đựng mẫu nuôi cấy; khay chai nuôi cấy thu hoạch; bút các loại.

+ Găng tay, cồn tuyệt đối và cồn 70°C, sát khuẩn tay nhanh, đăng kí sử dụng tủ an toàn sinh học, tủ ấm CO2, máy li tâm, bể ổn nhiệt, tủ ấm.

+ Ghi tên người bệnh/ mã số trên ống đựng bệnh phẩm, ống ly tâm, chai nuôi cấy.

+ Hóa chất cần dùng cho mỗi lần thực hiện quy trình: đảm bảo số lượng, hạn sử dụng, điều kiện bảo quản.

+ Các biểu mẫu theo dõi thực hiện quy trình (nếu có).

4.1.1. Nuôi cấy tế bào

- Thực hiện tất cả các thao tác trong tủ an toàn sinh học cấp II. Ghi đầy đủ thông tin vào phiếu theo dõi sử dụng tủ an toàn sinh học cấp II.

- Bật tủ theo đúng trình tự quy định, chạy khởi động trong 5 phút, vệ sinh bề mặt tủ an toàn sinh học bậc II bằng cồn 70°C, sau đó là dung dịch làm sạch và khử khuẩn bề mặt dùng trong y tế.

+ Lắc đều chai môi trường nuôi cấy, chia 6 mL môi trường vào từng chai nuôi cấy 25 cm2.

+ Dán nhãn ghi tên người bệnh, mã phòng xét nghiệm vào các chai nuôi cấy.

+ Sử dụng pipet để hút bệnh phẩm vào các chai nuôi cấy theo thể tích sau:

+ Mẫu máu ngoại vi: 500 µL với người bệnh sơ sinh (<1 tháng) (2,7-6 x 10⁶ tế bào bạch cầu); 600 µL với người bệnh trẻ lớn (> 1 tháng) (2,7-6 x 10⁶ tế bào bạch cầu)/1 chai nuôi cấy.

* Mẫu tủy xương: 500 µL/1 chai nuôi cấy

+ Lắc đều chai cấy để hòa tan mẫu hoàn toàn vào môi trường, đặt chai cấy nằm ngang trên khay cấy.

+ Đặt khay cấy trong tủ nuôi cấy ở 37°C và 5% CO₂ trong 72h.

+ Vệ sinh bề mặt tủ an toàn sinh học bậc II bằng cồn 70°C, dung dịch làm sạch và khử khuẩn bề mặt dùng trong y tế và tắt tủ theo đúng trình tự quy định.

4.1.2. Thực hiện thu hoạch tế bào sau nuôi cấy

- Sau 72 giờ nuôi cấy tế bào máu và sau 24h đối với nuôi cấy tế bào tủy xương, thêm 80 µL colcemid vào chai nuôi cấy (nồng độ 10 µL colcemid/1mL). Lắc đều, để trong tủ cấy ở 37°C trong 90 phút.

- Sau thời gian xử lý colcemid, lấy mẫu từ tủ cấy và lắc nhẹ chai nuôi cấy để mẫu hòa tan hoàn toàn vào dung dịch. Đổ mẫu sang ống ly tâm 15 mL, dán tên người bệnh, mã số PXN.

- Ly tâm 1800 vòng/5 phút, loại bỏ dịch nổi, trộn đều cặn.

- Thêm 8 mL dung dịch nhược trương (KCl), ủ mẫu trong bể ổn nhiệt nước 37°C trong 35 phút, lắc mẫu 10 phút/lần.

- Thêm 3 mL dung dịch cố định tế bào (cRNAoy), trộn đều, ly tâm 1800 vòng/5 phút, loại bỏ dịch nổi, trộn đều cặn.

- Thêm 8 mL dung dịch CRNAoy và trộn đều, ly tâm 1800 vòng/5 phút, loại bỏ dịch nổi, trộn đều cặn. Lặp lại bước này thêm 2 lần.

- Thêm 8 mL dung dịch CRNAoy và trộn đều, ly tâm 1800 vòng/5 phút, loại bỏ dịch nổi, chỉ để lại khoảng 500 - 1000 µL cặn tế bào.

- Tạo tiêu bản (lam)

+ Nhỏ 50 µL cặn tế bào của mỗi mẫu người bệnh sau thu hoạch lên tiêu bản dò, đưa tiêu bản qua ngọn lửa đèn cồn từ 8-10 giây. Dán nhãn của đúng người bệnh lên tiêu bản.

+ Kiểm tra mật độ và chất lượng cụm nhiễm sắc thể của tiêu bản dò trên kính hiển vi soi ngược:

+ Tiêu bản dò đạt tiêu chuẩn chất lượng khi: có khoảng 10 - 15 cụm NST trong 1 vi trường ở độ phóng đại 100 lần.

* Hình thái nhiễm sắc thể dài vừa đủ, không quá ngắn.

* Các nhiễm sắc thể trong cụm không quá rải rác hay tập trung.

- Ghi vào phiếu theo dõi thực hiện nuôi cấy, thu hoạch và nhuộm tế bào máu ngoại vi. Nếu tiêu bản dò đã đạt tiêu chuẩn chất lượng thì chuẩn bị thêm từ 3 tiêu bản/người bệnh.

- Nếu tiêu bản dò chưa đạt tiêu chuẩn chất lượng thì cần điều chỉnh các yếu tố sau:

Bảng 3: Chất lượng tiêu bản dò và cách xử lý

- Làm già các tiêu bản đạt tiêu chuẩn ở 37°C trong 2-3 ngày hoặc 60°C qua đêm.

- Chuyển cặn tế bào còn lại vào ống 2 mL, dán nhãn bao gồm mã số phòng xét nghiệm, tên người bệnh. Cặn tế bào lưu giữ trong hộp ở 4-8°C trong vòng 3 tháng hoặc ở -80°C trong thời gian dài hơn. Cặn tế bào được lưu giữ và hủy bỏ theo quy trình lưu giữ và thải bỏ mẫu bệnh phẩm.

- Vệ sinh bề mặt tủ hút bằng cồn 70°C, tắt tủ theo đúng quy định của nhà sản xuất.

4.1.3. Nhuộm băng

- Các bước thực hiện:

+ Nhúng tiêu bản vào cốc PBS trong bể ổn nhiệt 37°C

+ Bước 1: nhúng tiêu bản vào cốc trypsin, thời gian trypsin là 10 giây

+ Bước 2: rửa tiêu bản qua 2 cốc PBS ở nhiệt độ phòng

+ Bước 3: ngâm tiêu bản trong dung dịch Giemsa nhuộm 9 phút

+ Bước 4: rửa nhẹ dưới vòi nước và để khô

+ Kiểm tra chất lượng băng dưới kính hiển vi.

+ Chất lượng băng đạt yêu cầu khi đủ 400 băng của thang điểm đánh giá độ phân giải của băng G theo tổ chức di truyền học lâm sàng

* Nếu chất lượng băng chưa đạt yêu cầu cần tiến hành dò lại tiêu bản theo các bước từ 1-4 để xác định thời gian xử lý trypsin phù hợp. Nếu NST chưa cắt băng thì cần tăng thời gian xử lý trypsin lên 11 giây. Nếu NST bị cắt băng quá mức thì cần giảm thời gian xử lý trypsin xuống 9 giây.

* Nếu chất lượng băng đạt yêu cầu thì tiến hành nhuộm các tiêu bản còn lại theo các bước từ 1-4.

- Tiêu bản sau khi khô hoàn toàn được dán lamen 24x50 mm lên bề mặt bằng dung dịch DPX (nhỏ 2-3 giọt DPX lên bề mặt tiêu bán và phủ lamen lên trên, đuổi hết các bọt khí khỏi tiêu bản).

- Ghi vào phiếu theo dõi thực hiện nuôi cấy, thu hoạch và nhuộm tế bào.

4.1.4. Phân tích nhiễm sắc thể

- Mỗi mỗi bệnh phẩm cần được đếm và phân tích 20 cụm nhiễm sắc thể, trong đó ít nhất 3 cụm nhiễm sắc thể được lập karyotype.

- Trong trường hợp có dòng tế bào khác: Phân tích ít nhất 30 cụm NST.

- Không báo cáo kết quả với các trường hợp khảm thấp (nếu phân tích 30 cụm NST có thể không báo cáo trường hợp khảm <15%; nếu phân tích 50 cụm NST, có thể không báo cáo trường hợp khảm <9%).

4.2. Nhận định kết quả

- Xem xét kết quả: thực hiện nội kiểm chất lượng theo quy trình nội kiểm chất lượng.

- Đọc và nhận định kết quả: so sánh kết quả phân tích nhiễm sắc thể của người bệnh với bộ nhiễm sắc thể của người bình thường. Căn cứ vào số lượng, kích thước và độ phân giải băng của nhiễm sắc thể đưa ra được kết luận người bệnh có mang bất thường nhiễm sắc thể bất thường về số lượng hoặc cấu trúc.

+ Sau khi hoàn thành phân tích, đưa ra kết luận về Karyotype, lựa chọn 1 cụm có chất lượng tốt nhất để báo cáo hình ảnh. Đối với các trường hợp thể khảm, in đủ số ảnh đại diện cho từng dòng tế bào. Yêu cầu về cụm NST làm báo cáo: các băng rõ ràng, các nhiễm sắc thể tách rời nhau, phản ánh đúng và trung thực kết quả bất thường.

+ Nội dung báo cáo kết quả của người bệnh sẽ được thực hiện theo quy định (gồm các trang kết quả: giấy chỉ định xét nghiệm (trang 1), báo cáo kết quả (trang 2) và báo cáo hình ảnh công thức nhiễm sắc thế (từ trang 3, 1 ảnh trong trường hợp kết quả Công thức NST dạng thuần, nhiều ảnh trong các trường hợp có bất thường NST dạng khảm)).

+ Báo cáo kết quả sẽ được lưu theo quy định.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

4.3.1. Trả kết quả

- Báo cáo kết quả xét nghiệm được thực hiện theo các Quy trình liên quan, lưu hồ sơ và ghi vào biểu mẫu cần thiết và lưu hồ sơ xét nghiệm.

- Kết quả xét nghiệm cần được kiểm tra chéo, phê duyệt trước khi trả.

4.3.2. Lưu trữ hồ sơ

Hồ sơ xét nghiệm được lưu trữ theo quy định.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

- Các chất ảnh hưởng đến xét nghiệm (yếu tố nhiễu) và các phản ứng chéo, các chất ảnh hưởng đến xét nghiệm: chất chống đông EDTA, người bệnh mới truyền máu hoặc các chế phẩm máu trong vòng 1 tháng…

- Nhầm mẫu bệnh phẩm: lấy lại mẫu bệnh phẩm của người bệnh.

5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật

- Nhân viên không tuân thủ quy trình kỹ thuật: thực hiện lại quy trình kỹ thuật.

- Hóa chất hết hạn sử dụng và không được bảo quản đúng quy định của nhà sản xuất hoặc không được trộn đều trước khi chia sang các ống nhỏ hoặc trước khi hút: thay hóa chất mới.

- Nhiễm trùng: lấy lại mẫu, và tiến hành lại quy trình kỹ thuật.

5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật

- Nhầm mẫu bệnh phẩm: lấy lại mẫu bệnh phẩm của người bệnh.

- Thực hiện sai quy trình kỹ thuật: tiến hành lại xét nghiệm.

- Phân tích kết quả không chính xác: kiểm tra và phân tích chéo kết quả xét nghiệm hoặc xin ý kiến của bác sĩ lâm sàng.

- Mẫu chứng nội kiểm không có kết quả: cấy lại hoặc thay mẫu chứng khác.

- Báo cáo sai kết quả xét nghiệm: thông báo tới lãnh đạo khoa xét nghiệm và sửa lại kết quả xét nghiệm.

- Lựa chọn sai biểu mẫu báo cáo kết quả: báo cáo lãnh đạo khoa và sửa lại báo cáo kết quả.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

6.1. Nuôi cấy tế bào

- Mật độ tế bào đạt ≥ 70%, nhiều tế bào kì giữa tròn sáng.

6.2. Thu hoạch tế bào sau nuôi cấy

Số lượng cụm tế bào ≥ 10 tế bào/ 1 vi trường

6.3. Nhuộm băng G

- Chất lượng băng NST đạt tiêu chuẩn theo quy định: đảm bảo số lượng bặng 400-500 băng.

6.4. Phân tích nhiễm sắc thể

Hai nhân viên được đào tạo, có chứng chỉ chuyên môn, phân tích độc lập.

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Jean McGowan-Jordan, Ottawa, ON Ros J. Hastings.2020. An international system for human cytogenomic nomenclature (ISCN). Karger.

2. Marilyn S Arsham, Margaret J Barch, and Helen J. Lawce; The AGT cytogenetics laboratory manual; 4; The organization for cytogenetics and molecular professionals; Chromosome stain, 235-238.

3. Leversha M, Sinfield C and Webb G; Rapid and reliable methods for the G and C banding of Human Chromosomes; Aust J Med Lab Sci 1; 139-143

4. Mireille Claustres1, Viktor Kozˇich2, Els Dequeker3 et al. 2014. Recommendations for reporting results of diagnostic genetic testing. European Journal of Human Genetics 22, 160-170

5. Trần Đức Phấn, Lương Thị Lan Anh và cs. 2021. Di truyền y học. Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam.

6. Susan Mahler Zneimer, Ph.D., FACMGG. Cytogenetic Abnormalities, Chromosomal, FISH and Microarray - Based Clinical Reporting. Willey Blackwell.

Phụ lục: Hướng dẫn lập Karyotype theo danh pháp quốc tế

- Nhận định bộ NST người:

Bộ nhiễm sắc thể của người bình thường bao gồm 22 cặp NST thường và 1 cặp NST giới tính với karyotype được viết dưới dạng: 46,XX ở người nữ hoặc 46,XY ở người nam. 46 NST người được xếp thành 7 nhóm, ký hiệu là A, B, C, D, E, F và G, theo vị trí của phần tâm.

Hình 2: Công thức nhiễm sắc thể của người nam bình thường

Nhóm A (NST 1,2,3): kích thước lớn nhất, cặp số 1: tâm giữa, cặp số 2: tâm lệch, cặp số 3: tâm giữa.

Nhóm B (NST 4,5): kích thước lớn và tương đồng về chiều dài và đều có tâm lệch.

Nhóm C có 7 cặp NST, bao gồm từ số 6 đến số 12: có kích thước trung bình, tâm lệch. NST X cũng được xếp vào nhóm này.

Nhóm D có 3 cặp NST số 13, 14 và 15 : kích thước trung bình, đều là NST tâm đầu, có vệ tinh gắn vào cánh ngắn.

Nhóm E có 3 cặp NST số 16, 17 và 18, các NST này tương đối ngắn. NST số 16 có tâm giữa, còn cặp số 17 và 18 có tâm lệch.

Nhóm F có 2 cặp NST số 19 và số 20: kích thước ngắn, tâm giữa.

Nhóm G có 2 cặp NST số 21 và số 22: kích thước ngắn, tâm đầu và có vệ tinh.

NST Y cũng được xếp vào nhóm này, tuy nhiên NST Y không có vệ tinh.

- Thang điểm đánh giá độ phân giải băng G

Theo tổ chức di truyền học lâm sàng. Cụm NST có thể phân tích cần đảm bảo tối thiểu 400 băng theo tiêu chuẩn của tổ chức di truyền học lâm sàng.

Bảng 4: Thang điểm đánh giá độ phân giải của băng G theo tổ chức di truyền học lâm sàng

- Cách viết danh pháp quốc tế

+ Danh pháp quốc tế của các bất thường số lượng, bất thường cấu trúc và đa hình được viết đúng chuẩn của ISCN (An international system for human cytogenomic nomenclature).

+ Công thức nhiễm sắc thể được ghi như sau: [tổng số nhiễm sắc thể], [nhiễm sắc thể giới], [bất thường nhiễm sắc thể]. Nhiễm sắc thể thường chỉ được ghi khi có bất thường.

+ Ví dụ: 46,XX: Bộ NST nữ bình thường; 46,XY: Bộ NST nam bình thường

+ Bất thường số lượng NST dùng dấu + (tăng) hoặc - (giảm) viết trước NST để chỉ sự thay đổi số lượng NST, ví dụ: 47,XX,+21.

+ Bất thường số lượng NST giới được ghi như sau:

45,X: Bộ NST chỉ có 1 NST X (hội chứng Turner)

47,XXY: Bộ NST có 2 NST X và 1 NST Y ( Hội chứng Klinefelter)

47,XYY: Bộ NST có 1 NST X và 2 NST Y

48,XXXY: Bộ NST có 3 NST X và 1 NST Y

+ Trong các bất thường NST thì NST giới bất thường được ghi đầu tiên, tiếp theo là các bất thường NST thường sắp xếp theo thứ tự NST từ 1->22, các bất thường viết cách nhau bằng dấu phẩy (,). Ví dụ:47,X,i(X)(q10),+21.

Bảng 5: Một số kí hiệu thường dùng trong bất thường cấu trúc NST:

6. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ TẾ BÀO MÁU NGOẠI VI; TỦY XƯƠNG; CÁC TẾ BÀO MÔ KHÁC BẰNG KỸ THUẬT FISH

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Xét nghiệm nhiễm sắc thể tế bào máu ngoại vi; tế bào tủy xương bằng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang (Flurorescence In situ Hibridization - FISH) để phát hiện một số bất thường số lượng, cấu trúc ở mức độ nhiễm sắc thể (NST) phục vụ chẩn đoán, tiên lượng và điều trị bệnh.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

1.2.1. Định nghĩa

Kỹ thuật FISH là kỹ thuật di truyền dựa trên phân tích các tín hiệu huỳnh quang của các vùng NST, các gen, tổ hợp gen trong một tế bào. So sánh số lượng tín hiệu, màu sắc tín hiệu với tín hiệu trên tế bào bình thường theo quy định của hãng sản xuất các đầu dò. Từ đó đánh giá được bất thường số lượng NST dạng: đa bội, thiểu bội, lệch bội và các bất thường cấu trúc NST: mất đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn, khuếch đại.

1.2.2. Nguyên lý

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH (Fluorescent In-situ Hybridization) dựa trên nguyên lý bắt cặp các trình tự nhất định của người bệnh với đầu dò huỳnh quang theo nguyên tắc bổ sung. Các đầu dò huỳnh quang có kích thước từ 20 bp đến 1000 bp, đầu dò huỳnh quang có thể được đánh dấu vào vùng tận cùng của NST, tâm NST, các vùng gen đặc hiệu. Phân tích các tính hiệu huỳnh quang bằng hệ thống kính hiển vi huỳnh quang để phát hiện các dạng bất thường NST về số lượng và cấu trúc.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 02 người.

2.2. Vật tư

2.2.1. Dụng cụ

- Chai nuôi cấy có ống thông khí; chai thủy tinh (250mL, 500mL…); cốc thủy tinh; ống ly tâm nhọn (15mL…); Pipet nhựa vô trùng (10mL, 3mL…).

- Đầu côn có phin lọc 1000 µL, 200 µL, 10 µL; Lam kính SuperFrost hoặc xử lý polysine; Lamen phủ 22x22mm; 18x18mm.

- Khay đựng ống các thể tích (2mL, 15 mL…), khay đựng chai nuôi cấy.

2.2.2. Hóa chất/sinh phẩm

- Hóa chất dùng chung: nước cất 2 lần; 100% ethanol. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

- Ống đựng bệnh phẩm (ống đựng mẫu vô trùng chống đông Heparine…), găng tay; khẩu trang; mũ giấy; bông cồn; băng dính; văn phòng phẩm (giấy chỉ định, giấy hẹn trả kết quả xét nghiệm); sát khuẩn tay nhanh.

- Hóa chất nuôi cấy:

+ Nuôi cấy tế bào máu ngoại vi: sử dụng môi trường được bổ sung chất tối ưu hóa (bổ sung với FBS Bovine Serum (FBS), L-glutamine và PHA).

+ Nuôi cây tế bào tủy xương: sử dụng môi trường được bổ sung chất tối ưu hóa (bổ sung với FBS Bovine Serum (FBS), L-glutamine và PHA).

- Hóa chất thu hoạch tế bào:

+ Trypsin EDTA 1X: Rã đông ở 37°C, chia nhỏ vào các ống ly tâm 15mL vô trùng (13 mL/ống) và lưu giữ ở -20°C. Rã đông lần nữa ở 37°C trước khi sử dụng và bảo quản ở -4°C nếu chưa dùng hết.

+ Colcemid: bảo quản ở nhiệt độ 4°C. Đối với tế bào tủy xương: có thể sử dụng thêm hóa chất cần thiết trong quá trình thu hoạch để tăng số lượng cụm NST (Ethidium bromide…).

+ Acid acetic; Methanol; KCl.

- Hóa chất lai

+ Đầu dò huỳnh quang.

+ Thuốc nhuộm huỳnh quang (DAPI II couterstain…).

+ Dung dịch đệm lai (LSI…); SSC 20x; NP 40; dầu soi kính.

2.3. Trang thiết bị

- Tủ an toàn sinh học cấp II; tủ hút mùi hóa chất độc hại.

- Tủ nuôi cấy tế bào 37°C, 5% CO2.

- Hệ thống kính hiển vi chụp và phân tích công thức nhiễm sắc thể tự động miễn dịch huỳnh quang, phần mềm phân tích (FISH ISIS…); kính hiển vi soi ngược.

- Máy li tâm thường.

- Pipet các thể tích: 5-50mL; 0,5-10µL, 2-20µL và 200-1000 µL; 10 mL, 25 mL.

- Máy lai nhiệt, tủ lạnh và tủ âm các loại (-20°C; -40°C; -80°C…).

- Thiết bị phụ trợ: máy lắc; tủ ổn nhiệt khô; bể ổn nhiệt nước; máy hút dịch, nồi khử trùng ướt; tủ sấy khô; cân điện tử; lưu điện; nhiệt ẩm kế; nhiệt kế; máy in ảnh; máy in tem mã vạch.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Loại mẫu bệnh phẩm: tế bào máu ngoại vi, tế bào tủy xương.

- Mẫu bệnh phẩm sử dụng có thể là cặn tế bào sau khi nuôi cấy hoặc sau khi thu hoạch trực tiếp.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Kiểm tra phiếu chỉ định: kiểm tra thông tin theo quy định.

- Kiểm tra ống đựng bệnh phẩm: kiểm tra thông tin theo quy định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật

5,6 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Phòng xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử.

3. AN TOÀN

- Đảm bảo nguyên tắc an toàn sinh học.

- Đảm bảo an toàn theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Chuẩn bị chung các bước thực hiện xét nghiệm

+ Khay đựng mẫu nuôi cấy; khay chai nuôi cấy thu hoạch; bút các loại

+ Găng tay, cồn tuyệt đối và cồn 70°C, sát khuẩn tay nhanh, đăng kí sử dụng tủ an toàn sinh học, tủ ấm CO2, máy li tâm, bể ổn nhiệt, tủ ấm, …

+ Hóa chất cần dùng cho mỗi lần thực hiện quy trình: đảm bảo số lượng, hạn sử dụng, điều kiện bảo quản theo hướng dẫn của nhà sản xuất và yêu cầu của quy trình xét nghiệm.

+ Các biểu mẫu theo dõi thực hiện quy trình (nếu có).

4.1.1. Nuôi cấy tế bào sử dụng cho kỹ thuật Metapahase FISH

- Thực hiện tất cả các thao tác trong tủ an toàn sinh học cấp II. Ghi đầy đủ thông tin vào phiếu theo dõi sử dụng tủ an toàn sinh học cấp II

- Bật tủ theo đúng trình tự quy định, chạy khởi động trong 5 phút, vệ sinh bề mặt tủ an toàn sinh học bậc II bằng cồn 70°C, sau đó là dung dịch làm sạch và khử khuẩn bề mặt dùng trong y tế.

- Điền đầy đủ thông tin của người bệnh và kiểm tra chất lượng mẫu vào trong phiếu theo dõi thực hành (nếu có).

- Các bước thực hiện quy trình nuôi cấy các loại tế bào thực hiện theo quy trình “Xét nghiệm công thức Nhiễm sắc thể (Karyotype) máu ngoại vi; tủy xương”. Mẫu bệnh phẩm sau khi thu hoạch theo quy trình, thu được cặn tế bào sử dụng cho kỹ thuật Metaphase FISH.

4.1.2. Thu hoạch tế bào sử dụng cho kỹ thuật Interphase FISH

- Pha dung dịch nhược trương (nồng độ 0,56 g/mL).

- Làm ấm dung dịch Trypsin 1X.

- Pha dung dịch cố định tế bào (tỷ lệ 3 methanol/1 acid acetic).

- Chuẩn bị tiêu bản sạch.

- Trước thu hoạch 30 phút: làm ấm dung dịch Trypsin 1X (6 mL/mẫu) và KCl 0,075M (8 mL/mẫu) tại 37°C. Chuẩn bị tối thiểu 50 mL dung dịch CRNAoy theo tỷ lệ 3 thể tích Methanol với 1 thể tích Acid Acetic.

- Trộn đều và hút 200 mL mẫu máu ngoại vi sau xử lý trypsin ở bước trên chuyển vào ống ly tâm 15 mL, bổ sung 8 mL dung dịch KCl 0,075M đã làm ấm và ủ tại 37°C trong 30 phút.

- Sau ủ, bổ sung 2 mL dung dịch CRNAoy để làm dừng quá trình nhược trương. Ly tâm 1800 vòng/phút, loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn.

- Bổ sung 7 mL dung dịch CRNAoy, ly tâm 1800 vòng/phút, loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn. Lặp lại 2-3 lần..

- Sau lần ly tâm cuối, loại bỏ dịch nổi đến 50 mL, trộn đều cặn tế bào.

4.1.3. Tạo tiêu bản

- Chuẩn bị 1 tiêu bản có xử lý polysine cho 1 người bệnh.

- Ghi nhãn tiêu bản: mã số PXN, tên người bệnh, đầu dò.

- Đánh dấu vùng lai bằng bút dạ đen và bút kim cương.

- Nhỏ 7-10 µL cặn tế bào sau thu hoạch theo chiều thẳng đứng vào vùng lai đã đánh dấu.

- Kiểm tra mật độ và chất lượng tế bào dưới kính hiển vi soi ngược. Nếu quan sát được từ 15-20 tế bào trong 1 vi trường thì vùng lai đạt tiêu chuẩn. Nếu mật độ tế bào ít hơn thì cần phun thêm cho đến khi đạt tiêu chuẩ Nếu mật độ tế bào quá dày (~50 tế bào/ vi trường) thì cần pha loãng cặn tế bào (cho thêm dung dịch canroy vào cặn tế bào) và phun lại vùng lai khác.

4.1.4. Lai huỳnh quang

- Ngâm 2 thanh ẩm vào nước trong 5 phút và lắp vào máy lai.

- Làm tan đầu dò và đệm ở nhiệt độ phòng, ly tâm nhanh 1-3 phút .

- Chuẩn bị: hai pipet (01 pipet 0,5-2 µL và 01 pipet 10µL); hai loại đầu côn có lọc 10 µL, chống dính và không chống dính; Lamen 18x18 mm.

- Nhỏ lần lượt đầu dò và dung dịch đệm lên lamen 18x18 mm theo hướng dẫn của nhà sản xuất, trộn đều bằng pipet.

- Úp phần vùng tế bào đã đánh dấu trên tiêu bản vào lamen chứa hỗn hợp đầu dò, đuổi hết bóng khí (nếu có) và cố định lamen bằng keo cao su.

- Đặt tiêu bản vào máy lai nhiệt, chọn chu trình lai phù hợp.

4.1.5. Rửa sau lai a. Chuẩn bị:

- Chuẩn bị 3 cốc nhựa hoặc thuỷ tinh chịu nhiệt:

+ Cốc 1: 100 mL dung dịch SSX 2X, bổ sung 300 µL NP40, để trong bể ổn nhiệt 75°C

+ Cốc 2: 100 mL dung dịch SSX 2X, bổ sung 300 µL NP40, để ở nhiệt độ phòng

+ Cốc 3: 100 mL nước cất, để ở nhiệt độ phòng

+ Đồng hồ bấm giây; Pipet 1-10 µL

b. Thực hiện

- Tắt điện phòng, tránh ánh sáng trong quá trình rửa lam

- Lấy tiêu bản ra khỏi máy lai, bóc keo cao su và loại bỏ lamen

- Rửa tiêu bản trong coóng 1 tại 75°C trong 3 phút.

- Rửa tiếp tiêu bản trong coóng 2 tại nhiệt độ phòng trong 2 phút

- Rửa nhanh tiêu bản trong vài giây ở coóng 3 và để tiêu bản khô tự nhiên tại nhiệt độ phòng

- Nhỏ 7 µL DAPI vào vùng tế bào lai đầu dò đã đánh dấu trên tiêu bản

- Phủ lamen 22x22 mm lên vùng đánh dấu, đuổi bọt khí và cố định lamen bằng sơn móng tay

- Cất tiêu bản vào khay và giữ trong ngăn đá tủ lạnh khoảng 2-3 phút đến khi phân tích kết quả

4.1.6. Phân tích kết quả

- Phân tích trên kính hiển vi huỳnh quang, tìm vi trường trên tiêu bản ở vật kính 10x với bộ lọc màu DAPI

- Khi đã xác định được vi trường, chuyển sang vật kính dầu 100x, nhỏ dầu và dùng nút vi cấp lấy nét của vi trường ở độ phóng đại mới

- Di chuyển tiêu bản theo một hướng nhất định (ví dụ: từ trái sang phải, từ trên xuống dưới). Khi thấy tế bào, quan sát các tín hiệu khác nhau bằng cách chuyển các bộ lọc, đếm số lượng tín hiệu quan sát được. Ghi số lượng tín hiệu vào phiếu phân tích kết quả FISH.

- Chụp lại hình ảnh tế bào bằng phần mềm phân tích tín hiệu huỳnh quang.

- Khi đã phân tích đủ số lượng, đưa ra kết luận cuối cùng và làm báo cáo trả kết quả.

4.2. Nhận định kết quả

- Xem xét mẫu nội kiểm: mẫu nội kiểm chất lượng trong tất cả các bước thực hiện quy trình đạt yêu cầu.

- Phân tích nhận định kết quả: so sánh số lượng, màu sắc, cách biểu hiển tín hiệu huỳnh quang với tín hiệu chuẩn của nhà sản xuất.

- Phiên giải và báo cáo kết quả: khi đã phân tích đủ số lượng, đưa ra kết luận người bệnh có mang các bất thường NST hay không.

- Nội dung báo cáo kết quả, lưu kết quả xét nghiệm được thực hiện theo quy định.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

4.3.1. Trả kết quả

- Báo cáo kết quả xét nghiệm được thực hiện theo các quy trình liên quan, lưu hồ sơ và ghi vào biểu mẫu cần thiết và lưu hồ sơ xét nghiệm.

- Kết quả xét nghiệm cần được kiểm tra chéo, phê duyệt trước khi trả.

4.3.2. Lưu trữ hồ sơ

- Hồ sơ xét nghiệm được lưu theo quy định.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

- Các chất ảnh hưởng đến xét nghiệm (yếu tố nhiễu) và các phản ứng chéo, các chất ảnh hưởng đến xét nghiệm: chất chống đông EDTA, người bệnh mới truyền máu hoặc các chế phẩm máu trong vòng 1 tháng…

- Nhầm mẫu bệnh phẩm: lấy lại mẫu bệnh phẩm của người bệnh.

5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật

- Nhân viên không tuân thủ quy trình kỹ thuật: thực hiện lại quy trình kỹ thuật.

- Hóa chất hết hạn sử dụng và không được bảo quản đúng quy định của nhà sản xuất hoặc không được trộn đều trước khi chia sang các ống nhỏ hoặc trước khi hút.

- Nhiễm trùng: lấy lại mẫu, và tiến hành lại quy trình kỹ thuật.

5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật

- Nhầm mẫu bệnh phẩm: lấy lại mẫu bệnh phẩm của người bệnh.

- Thực hiện sai quy trình kỹ thuật: tiến hành lại xét nghiệm.

- Phân tích kết quả không chính xác: kiểm tra và phân tích chéo kết quả xét nghiệm hoặc xin ý kiến của bác sĩ lâm sàng.

- Mẫu chứng nội kiểm không có kết quả: cấy lại hoặc thay mẫu chứng khác.

- Báo cáo sai kết quả xét nghiệm: thông báo tới lãnh đạo khoa xét nghiệm và sửa lại kết quả xét nghiệm.

- Lựa chọn sai biểu mẫu báo cáo kết quả: báo cáo lãnh đạo khoa và sửa lại báo cáo kết quả.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

6.1. Nuôi cấy tế bào

- Thể tích môi trường và mẫu bệnh phẩm đảm bảo đúng theo quy trình.

- Chất lượng mẫu sau nuôi cấy được đánh giá bằng quan sát: mẫu máu đỏ tươi, không đông vón, không vẩn đục, không thay đổi màu sắc.

- Chai nuôi cấy nội kiểm không nhiễm trùng.

6.2. Thu hoạch tế bào sau nuôi cấy hoặc thu hoạch tế bào trực tiếp

- Chất lượng tế bào trước và sau nuôi cấy, đảm bảo vô trùng.

- Giá trị báo động/nguy hiểm: nếu số lượng cụm tế bào NST <10 tế bào/vi trường thì tiêu bản không đạt chất lượng.

- Cách xử lý nếu chất lượng mẫu thu hoạch sau nuôi cấy hoặc thu hoạch trực tiếp: ly tâm lại cặn tế bào, tạo tiêu bản và kiểm tra lại hoặc thực hiện lại quy trình.

6.3. Lai huỳnh quang

- Chất lượng tín hiệu rõ ràng, đủ tiêu chuẩn nhận định

- Hóa chất được bảo quản theo các khuyến cáo của nhà sản xuất.

6.4. Phân tích tín hiệu huỳnh quang

- Tiêu chuẩn phân tích:

+ Mỗi người bệnh được phân tích bởi hai nhân viên độc lập

+ Tín hiệu huỳnh quang rõ ràng, sắc nét

+ Đảm bảo đủ số tế bào được phân tích, phù hợp với chỉ định của người bệnh.

- Đối với kỹ thuật Metaphase FISH: số lượng tế bào phân tích tối thiểu 10 tế bào, nếu phát hiện tình trạng khảm tăng số lượng tế bào phân tích là 30.

- Đối với kỹ thuật Interphase FISH: số lượng tế bào phân tích tối thiểu là 50, nếu phát hiện tình trạng khảm tăng số lượng tế bào phân tích là 100 tế bào.

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Jean McGowan-Jordan, Ottawa, ON Ros J. Hastings.2020. An international system for human cytogenomic nomenclature (ISCN). Karger.

2. Marilyn S Arsham, Margaret J Barch, and Helen J. Lawce; The AGT cytogenetics laboratory manual; 4; The organization for cytogenetics and molecular professionals; Chromosome stain, 235-238.

3. Leversha M, Sinfield C and Webb G; Rapid and reliable methods for the G and C banding of Human Chromosomes; Aust J Med Lab Sci 1; 139-143

4. Mireille Claustres1, Viktor Kozˇich2, Els Dequeker3 et al. 2014. Recommendations for reporting results of diagnostic genetic testing. European Journal of Human Genetics 22, 160-170

5. Trần Đức Phấn, Lương Thị Lan Anh và cs. 2021. Di truyền y học. Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam.

7. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TIÊU BẢN MÔ BẰNG KỸ THUẬT FISH

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

- Xét nghiệm nhiễm sắc thể (NST) trên tiêu bản mô bệnh học bằng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang (Flurorescence In situ Hibridization - FISH) để phát hiện một số bất thường số lượng, cấu trúc ở mức độ nhiễm sắc thể.

- Xét nghiệm FISH trên tiêu bản mô bệnh học thường được chỉ định trong các bệnh lý nghi ngờ có liên quan đến bất thường NST hoặc biến đổi gen, nhằm phục vụ cho chẩn đoán, tiên lượng và điều trị.

- Mục đích nhằm phát hiện các bất thường NST đặc hiệu, khuếch đại gen, mất đoạn hoặc tái sắp xếp gen…

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

1.2.1. Định nghĩa

Kỹ thuật FISH là kỹ thuật di truyền dựa trên phân tích các tín hiệu huỳnh quang của các vùng NST, các gen, tổ hợp gen trong một tế bào. So sánh số lượng tín hiệu, màu sắc tín hiệu với tín hiệu trên tế bào bình thường theo quy định của hãng sản xuất các đầu dò. Từ đó đánh giá được bất thường số lượng NST dạng: đa bội, thiểu bội, lệch bội và các bất thường cấu trúc NST: mất đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn, khuếch đại.

1.2.2. Nguyên lý

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH (Fluorescent In-situ Hybridization) dựa trên nguyên lý bắt cặp các trình tự nhất định của người bệnh với đầu dò huỳnh quang theo nguyên tắc bổ sung. Các đầu dò huỳnh quang có kích thước từ 20 bp đến 1000 bp, đầu dò huỳnh quang có thể được đánh dấu vào vùng tận cùng của NST, tâm NST, các vùng gen đặc hiệu. Phân tích các tính hiệu huỳnh quang bằng hệ thống kính hiển vi huỳnh quang để phát hiện các dạng bất thường NST về số lượng và cấu trúc.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 01 người.

2.2. Vật tư

2.2.1. Dụng cụ

- Chai thủy tinh (250mL, 500mL…); cốc thủy tinh.

- Ống ly tâm nhọn 15mL; pipet nhựa vô trùng 10mL, 3mL; đầu côn có phin lọc 1000 µL, 200 µL, 10 µL.

- Lam kính (SuperFrost hoặc xử lý polysine); Lamen phủ 22x22mm; 18x18mm.

- Khay đựng ống 2mL, khay đựng mẫu u.

2.2.2. Hóa chất/sinh phẩm

- Nước cất 2 lần; 100% ethanol.

- Ống đựng bệnh phẩm (ống đựng mẫu vô trùng, chống đông heparine…), găng tay; khẩu trang; mũ giấy; bông cồn; băng dính; văn phòng phẩm (giấy chỉ định, giấy hẹn trả kết quả xét nghiệm); sát khuẩn tay nhanh.

- Hóa chất lai: đầu dò huỳnh quang; thuốc nhuộm huỳnh quang (DAPI II couterstain); dung dịch đệm lai (LSI…), SSC 20x; NP 40.

- Dầu soi kính.

2.3. Trang thiết bị

- Hệ thống kính hiển vi chụp và phân tích công thức nhiễm sắc thể tự động miễn dịch huỳnh quang, phần mềm phân tích NST Karyotyping.

- Tủ hút mùi hóa chất độc hại; tủ lạnh và tủ âm các loại (-20°C; -40°C; -80°C).

- Máy li tâm thường; máy lai nhiệt.

- Pipets (0,5-10 µL, 2-20 µL, 200-1000 µL…); Pipet Spenser (10 mL, 25 mL…).

- Thiết bị phụ trợ: máy lắc; tủ ổn nhiệt khô; bể ổn nhiệt nước; máy hút dịch, nồi khử trùng ướt; tủ sấy khô; lưu điện; nhiệt ẩm kế; nhiệt kế.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Loại mẫu bệnh phẩm:

- Tiêu bản u tươi chưa qua cố định.

- Mảnh u được cố định bằng paraffin sau khi sinh thiết.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Kiểm tra phiếu chỉ định: kiểm tra thông tin theo quy định.

- Kiểm tra ống đựng bệnh phẩm: kiểm tra thông tin theo quy định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật

9 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Phòng xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử.

3. AN TOÀN

- Đảm bảo nguyên tắc an toàn sinh học.

- Đảm bảo an toàn theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Chuẩn bị chung các bước thực hiện xét nghiệm

+ Khay đựng mẫu, bút các loại.

+ Găng tay, cồn tuyệt đối và cồn 70°C, sát khuẩn tay nhanh, đăng kí sử dụng tủ an toàn sinh học, tủ ấm CO2, máy li tâm, bể ổn nhiệt, tủ ấm.

+ Hóa chất cần dùng cho mỗi lần thực hiện quy trình: đảm bảo số lượng, hạn sử dụng, điều kiện bảo quản.

+ Các biểu mẫu theo dõi thực hiện quy trình (nếu có).

4.1.1. Tạo tiêu bản trên mẫu u tươi

- Chuẩn bị 1 tiêu bản có xử lý polysine cho 1 người bệnh

- Ghi nhãn tiêu bản: mã số PXN, tên người bệnh, đầu dò

- Mẫu bệnh phẩm u có kích thước phù hợp 0,5-1cm/1 cạnh và tỉ lệ tế bào u tối thiểu 10 %, được cắt bằng máy cắt lạnh, độ dày lát cắt 2-5 micromet dàn lên lam.

- Lam được cố định trong dung dịch cố định tế bào (Metanol/acid acetic: 3/1) trong 15’, sau đó để khô tự nhiên.

- Đánh dấu vùng lai bằng bút dạ đen và bút kim cương.

4.1.2. Tạo tiêu bản trên mẫu u nến

- Đặt coplinjar chứa dung dịch Pretreatment vào bể ổn nhiệt 95°C để làm ấm trước.

- Sử dụng lam Polysine, ghi rõ họ tên người bệnh, ngày tháng năm sinh, giới, Labcode.

- Mẫu bệnh phẩm u có kích thước phù hợp 0,5-1cm/1 cạnh và tỉ lệ tế bào u tối thiểu 10 %, được cắt bằng máy cắt block nến, độ dày lát cắt 2-5 micromet dàn lên lam.

- Đánh dấu vùng lai bằng bút dạ đen và bút kim cương.

4.1.3. Lai huỳnh quang a. Chuẩn bị:

- Ngâm 2 thanh ẩm vào nước trong 5 phút và lắp vào máy lai;

- Làm tan đầu dò và đệm ở nhiệt độ phòng, ly tâm nhanh 1-3 phút;

- Hai pipet: 01 pipet 0,5-2 µL và 01 pipet 10µL;

- Hai loại đầu côn có lọc 10 µL chống dính và không chống dính;

- Lamen 18x18 mm. b. Thực hiện:

- Chuẩn bị đầu dò: nhỏ lần lượt đầu dò và dung dịch đệm lên lamen 18x18 mm theo hướng dẫn của nhà sản xuất, trộn đều bằng pipet.

- Úp phần vùng tế bào đã đánh dấu trên tiêu bản vào lamen chứa hỗn hợp đầu dò, đuổi hết bong bóng (nếu có) và cố định lamen bằng keo cao su.

- Đặt tiêu bản vào máy lai nhiệt, chọn chu trình lai phù hợp

4.1.4. Rửa sau lai a. Chuẩn bị:

- Chuẩn bị 3 cốc nhựa hoặc thuỷ tinh chịu nhiệt:

+ Cốc 1: 100 mL dung dịch SSX 2X, bổ sung 300 µL NP40, để trong bể ổn nhiệt 75°C

+ Cốc 2: 100 mL dung dịch SSX 2X, bổ sung 300 µL NP40, để ở nhiệt độ phòng.

+ Cốc 3: 100 mL nước cất, để ở nhiệt độ phòng.

- Đồng hồ bấm giây

- Pipet 10 µL

b. Thực hiện:

- Tắt điện phòng, tránh ánh sáng trong quá trình rửa lam

- Lấy tiêu bản ra khỏi máy lai, bóc keo cao su và loại bỏ lamen

- Rửa tiêu bản trong coóng 1 tại 75°C trong 3 phút.

- Rửa tiếp tiêu bản trong coóng 2 tại nhiệt độ phòng trong 2 phút

- Rửa nhanh tiêu bản trong vài giây ở coóng 3 và để tiêu bản khô tự nhiên tại nhiệt độ phòng

- Nhỏ 7 µL DAPI vào vùng tế bào lai đầu dò đã đánh dấu trên tiêu bản

- Phủ lamen 22x22 mm lên vùng đánh dấu, đuổi bọt khí và cố định lamen bằng sơn móng tay

- Cất tiêu bản vào khay và giữ trong ngăn đá tủ lạnh khoảng 2-3 phút đến khi phân tích kết quả

4.1.5. Phân tích kết quả

- Phân tích trên kính hiển vi huỳnh quang

- Tìm vi trường trên tiêu bản ở vật kính 10x với bộ lọc màu DAPI

- Khi đã xác định được vi trường, chuyển sang vật kính dầu 100x, nhỏ dầu và dùng nút vi cấp lấy nét của vi trường ở độ phóng đại mới

- Di chuyển tiêu bản theo một hướng nhất định (ví dụ: từ trái sang phải, từ trên xuống dưới). Khi thấy tế bào, quan sát các tín hiệu khác nhau bằng cách chuyển các bộ lọc, đếm số lượng tín hiệu quan sát được. Ghi số lượng tín hiệu vào phiếu phân tích kết quả FISH.

- Chụp lại hình ảnh tế bào bằng phần mềm phân tích tín hiệu huỳnh quang.

- Khi đã phân tích đủ số lượng, đưa ra kết luận và làm báo cáo trả kết quả.

4.2. Nhận định kết quả

- Phân tích nhận định kết quả: so sánh số lượng, màu sắc, cách biểu hiển tín hiệu huỳnh quang với tín hiệu chuẩn của nhà sản xuất.

- Phiên giải và báo cáo kết quả: khi đã phân tích đủ số lượng, đưa ra kết luận người bệnh có mang các bất thường NST hay không.

- Nội dung báo cáo và lưu báo cáo thực hiện theo quy định.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

4.3.1. Trả kết quả

- Báo cáo kết quả xét nghiệm được thực hiện theo các quy trình liên quan, lưu hồ sơ và ghi vào biểu mẫu cần thiết và lưu hồ sơ xét nghiệm.

- Kết quả xét nghiệm cần được kiểm tra chéo, phê duyệt trước khi trả.

4.3.2. Lưu trữ hồ sơ

Hồ sơ xét nghiệm được lưu trữ theo quy định.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

- Các chất ảnh hưởng đến xét nghiệm (yếu tố nhiễu) và các phản ứng chéo, các chất ảnh hưởng đến xét nghiệm: lượng mô sinh thiết, vị trí mô sinh thiết, chất lượng đúc nến.

- Nhầm mẫu bệnh phẩm: lấy lại mẫu bệnh phẩm của người bệnh.

5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật

- Nhân viên không tuân thủ quy trình kỹ thuật: thực hiện lại quy trình kỹ thuật.

- Hóa chất hết hạn sử dụng và không được bảo quản đúng quy định của nhà sản xuất hoặc không được trộn đều trước khi chia sang các ống nhỏ hoặc trước khi hút.

- Nhiễm trùng: lấy lại mẫu, và tiến hành lại quy trình kỹ thuật.

5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật

- Nhầm mẫu bệnh phẩm: lấy lại mẫu bệnh phẩm của người bệnh.

- Thực hiện sai quy trình kỹ thuật: tiến hành lại xét nghiệm.

- Phân tích kết quả không chính xác: kiểm tra và phân tích chéo kết quả xét nghiệm hoặc xin ý kiến của bác sĩ lâm sàng.

- Mẫu chứng nội kiểm không có kết quả: cấy lại hoặc thay mẫu chứng khác.

- Báo cáo sai kết quả xét nghiệm: thông báo tới lãnh đạo khoa xét nghiệm và sửa lại kết quả xét nghiệm.

- Lựa chọn sai biểu mẫu báo cáo kết quả: báo cáo lãnh đạo khoa và sửa lại báo cáo kết quả.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

6.1. Tạo tiêu bản

- Trước khi thực hiện quy trình:

+ Kiểm tra hạn sử dụng của các hóa chất.

+ Kiểm tra hoạt động của dụng cụ hỗ trợ pipet (pipet aid), các pipet vô trùng, các ống ly tâm vô trùng, chai nuôi cấy vô trùng, đầu côn vô trùng…

+ Kiểm tra sự vô trùng của trang thiết bị cần có sự khử trùng như: chai thủy tinh, pipet 10 mL, đảm bảo bao bì đóng gói khi khử trùng không bị rách, hở…

- Tiêu bản được tạo sau khi có kết quả hướng dẫn của kết quả giải phẫu bệnh, đảm bảo vùng lai trên tiêu bản là vùng chứa tế bào u.

6.2. Lai huỳnh quang

- Chất lượng tín hiệu rõ ràng, đủ tiêu chuẩn nhận định

- Hóa chất được bảo quản theo các khuyến cáo của nhà sản xuất.

6.3. Phân tích tín hiệu huỳnh quang

- Tiêu chuẩn phân tích:

+ Mỗi người bệnh được phân tích bởi hai nhân viên độc lập

+ Tín hiệu huỳnh quang rõ ràng, sắc nét

+ Đảm bảo đủ số tế bào được phân tích, phù hợp với chỉ định của người bệnh.

- Đối với phân tích kỹ thuật FISH trên tiêu bản u: số lượng tế bào phân tích tối thiểu là 50 tế bào, nếu phát hiện tình trạng khảm tăng số lượng tế bào phân tích là 100 tế bào.

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Jean McGowan-Jordan, Ottawa, ON Ros J. Hastings.2020. An international system for human cytogenomic nomenclature (ISCN). Karger.

2. Mireille Claustres1, Viktor Kozˇich2, Els Dequeker3 et al. 2014. Recommendations for reporting results of diagnostic genetic testing. European Journal of Human Genetics 22, 160-170.

3. Trần Đức Phấn, Lương Thị Lan Anh và cs. 2021. Di truyền y học. Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam.

8. XÉT NGHIỆM NHIỄM SẮC THỂ THEO DÒNG TẾ BÀO BẰNG KỸ THUẬT FISH

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Kỹ thuật nhằm xác định các bất thường về số lượng hoặc cấu trúc của nhiễm sắc thể trong nhân tế bào theo từng dòng tế bào khác nhau (như dòng tuỷ, lympho, plasma...).

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Xét nghiệm nhiễm sắc thể theo dòng tế bào được thực hiện trên nguyên lý của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ - FISH (Fluorescent in-situ hybridization). Nguyên lý kỹ thuật dựa trên cơ sở của phản ứng lai DNA. Trong tế bào, phân tử DNA tồn tại dưới dạng phân tử kép gồm 2 chuỗi đơn gắn kết bổ sung với nhau thông qua liên kết hydro. Liên kết hydro là liên kết yếu nên dễ dàng bị đứt gãy dưới tác động của nhiệt độ hay pH cao. Lúc đó, phân tử DNA bị tách thành 2 sợi đơn. Tuy nhiên khi nhiệt độ hay pH thay đổi, liên kết hydro cũng nối lại nhanh chóng. Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH sử dụng các đầu dò đặc hiệu có gắn huỳnh quang để lai ghép với các đoạn DNA tương đồng trên NST sau khi tách dòng tế bào. Các đoạn dò DNA được đánh dấu huỳnh quang sẽ được lai gắn lên các vị trí tương ứng trên nhiễm sắc thể đích. Sau lai, sản phẩm được quan sát dưới kính hiển vi để tìm tín hiệu huỳnh quang của các đoạn dò được lai. Sự có mặt hay không có tín hiệu huỳnh quang thể hiện có hay không có sự hiện diện của cấu trúc nhiễm sắc thể đặc hiệu tương ứng. Từ đó, xét nghiệm có thể phát hiện bất thường nhiễm sắc thể theo các dòng tế bào một cách chính xác và nhanh chóng.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 02 người.

2.2. Vật tư

- Kit tách tế bào bạch cầu;

- Hóa chất tách dòng tế bào bạch cầu;

- Probe đặc hiệu và sinh phẩm kèm theo;

- 20X SSC;

- NP-40;

- Ficoll;

- PBS 1X;

- DAPI;

- Nước cất, cồn tuyệt đối, xi măng cao su.

2.3. Trang thiết bị

- Bể ổn nhiệt;

- Máy lai FISH;

- Máy ly tâm, máy vortex;

- Kính hiển vi huỳnh quang.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm là 1-2 mL tủy xương chống đông Sodium Heparin. Bảo quản 2-8°C, giao mẫu đến khoa xét nghiệm trong vòng 24 giờ kể từ khi lấy mẫu.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm, yêu cầu xét nghiệm.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật

Ước tính từ lúc bắt đầu cho đến khi kết thúc xét nghiệm: 36 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Phòng xét nghiệm Di truyền - Sinh học phân tử.

3. AN TOÀN

- Nhân viên phải mang găng tay, khẩu trang và mặc trang phục y tế trong suốt quá trình làm xét nghiệm.

- Phân loại đúng rác thải và loại bỏ rác thải ngay sau quá trình thực hiện xét nghiệm.

- Thực hiện kiểm soát điều kiện môi trường theo “Quy trình theo dõi và kiểm soát điều kiện môi trường”.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

4.1.1. Chuẩn bị tiêu bản

- Chuẩn bị hồ sơ xét nghiệm.

- Tách bạch cầu từ mẫu bệnh phẩm theo hướng dẫn đi kèm của bộ sinh phẩm sử dụng.

- Tách tế bào theo dòng, thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của bộ sinh phẩm sử dụng.

- Nhược trương, cố định màng tế bào, nhỏ huyền dịch tế bào lên lam kính, sấy khô lam kính theo hướng dẫn đi kèm của nhà sản xuất.

4.1.2. Chuẩn bị probe

Chuẩn bị probe đặc hiệu theo mục đích xét nghiệm, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

4.1.3. Lai

- Nhỏ dung dịch probe vào vùng nhỏ tế bào trên tiêu bản sau đó che phủ bằng coverslip.

- Yêu cầu: dung dịch probe dàn đều trên tiêu bản, không có bọt khí.

- Phủ kín coverslip bằng xi măng cao su.

- Đặt vào máy lai, chọn chế độ lai theo hướng dẫn đi kèm của bộ sinh phẩm.

4.1.4. Rửa sau khi lai

- Gỡ bỏ xi măng cao su và coverslip ra khỏi tiêu bản.

- Ngâm và lắc mạnh tiêu bản lần lượt qua các cóng chứa các dung dịch hóa chất (SSC và NP40 pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất) để rửa sạch các probe và hóa chất còn thừa.

4.1.5. Chống mất màu probe

- Nhỏ dung dịch DAPI lên vùng lai để chống mất màu probe và nhuộm nhân tế bào.

- Phủ kín tiêu bản bằng coverslip.

Yêu cầu: dung dịch dàn đều trên tiêu bản và không có bọt khí.

4.2. Phân tích, nhận định kết quả

Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, với kỹ thuật dual colour FISH, chúng ta sẽ thấy các màu:

- Màu xanh da trời: màu nhân tế bào.

- Màu xanh lá cây: màu của probe.

- Màu đỏ: màu của probe.

- Màu xanh da trời đậm (aqua): mầu của probe.

Tùy theo loại probe đặc hiệu được sử dụng, tiến hành nhận định và phân tích kết quả theo hướng dẫn của nhà sản xuất đi kèm theo từng loại probe tương ứng.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét nghiệm.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Yêu cầu nội kiểm chất lượng: Thực hiện nội kiểm 01 lần/tuần. Khi phân tích kết quả phải có tín hiệu rõ ràng, không bị nhiễu.

- Yêu cầu ngoại kiểm (không bắt buộc): Thực hiện ngoại kiểm/ so sánh liên phòng tối thiểu 1 lần/1 năm, thời gian ngoại kiểm/ so sánh liên phòng ấn định theo chương trình của đơn vị tổ chức ngoại kiểm chất lượng.

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Emanuela VV and Joanna MB. FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique. BioTechniques. 2008; 45:4, 385-409.

2. Ruth BP, Kent MR. Application of fluorescence in situ hybridization (FISH) techniques to fish genetics: a review. Aquaculture. 1996; 140:3, 197-216

3. Małgorzata W, Elżbieta K, Katarzyna L, Bartosz B. Hematological methods in FISH - Not only for beginners. Aquaculture. 2022; 547. 737498.

4. Fazio F. FISH hematology analysis as an important tool of aquaculture: a review. Aquaculture. 2019 Feb 1;500:237-42.

5. Grant KR. FISH hematology and associated disorders. Veterinary Clinics: Exotic Animal Practice. 2015 Jan 1;18(1):83-103.

6. Hesser EF. Methods for routine FISH hematology. The Progressive Fish-Culturist. 1960 Oct 1;22(4):164-71.

9. XÉT NGHIỆM TỶ LỆ KHẢM TRONG GHÉP TẾ BÀO GỐC KHÁC GIỚI BẰNG KỸ THUẬT FISH

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Kỹ thuật xác định tỷ lệ tế bào mang nhiễm sắc thể giới tính XX/XY trong các trường hợp ghép tế bào gốc khác giới, nhằm mục đích theo dõi đáp ứng cũng như đánh giá điều trị người bệnh sau ghép.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Ghép tế bào gốc tạo máu là phương pháp truyền tế bào gốc tạo máu vào nhằm mục đích thiết lập lại việc sản sinh tế bào máu cho người bệnh có hệ thống miễn dịch hoặc tủy xương bị khiếm khuyết hay tổn thương. Trong những trường hợp ghép tế bào gốc tạo máu từ người cho khác giới tính, để theo dõi điều trị cũng như đánh giá đáp ứng của người bệnh, có thể sử dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH). Kỹ thuật FISH được tiến hành dựa trên cơ sở của phản ứng lai DNA. Trong tế bào, phân tử DNA tồn tại dưới dạng phân tử kép gồm 2 chuỗi đơn gắn kết bổ sung với nhau thông qua liên kết hydro. Liên kết hydro là liên kết yếu nên dễ dàng bị đứt gãy dưới tác động của nhiệt độ hay pH cao. Lúc đó, phân tử DNA bị tách thành 2 sợi đơn. Tuy nhiên khi nhiệt độ hay pH thay đổi, liên kết hydro cũng nối lại nhanh chóng. Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH sử dụng các đầu dò đặc hiệu có gắn huỳnh quang để lai ghép với các đoạn DNA tương đồng và đặc trưng trên NST giới tính X và Y. Từ đó có thể phát hiện tỷ lệ tế bào mang nhiễm sắc thể giới tính XX/XY trên các dòng tế bào một cách chính xác và nhanh chóng.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 02 người.

2.2. Vật tư

- Hóa chất tách tế bào bạch cầu;

- Hóa chất tách dòng tế bào;

- Probe đặc hiệu và sinh phẩm kèm theo;

- Dung dịch tẩy rửa đặc hiệu;

- DAPI/ thuốc nhuộm nhân tế bào;

- Nước cất, cồn tuyệt đối, xi măng cao su.

2.3. Trang thiết bị

- Bể ổn nhiệt;

- Máy lai FISH;

- Máy ly tâm, máy vortex;

- Kính hiển vi huỳnh quang.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm là 1-2 mL máu toàn phần/tủy xương chống đông Sodium Heparin. Bảo quản 2-8°C, giao mẫu đến khoa xét nghiệm trong vòng 24 giờ kể từ khi lấy mẫu.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm, yêu cầu xét nghiệm.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật

Ước tính từ lúc bắt đầu cho đến khi kết thúc xét nghiệm: 36 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Phòng xét nghiệm đủ tiêu chuẩn thực hiện xét nghiệm Di truyền và Sinh học phân tử.

3. AN TOÀN

- Nhân viên phải mang găng tay, khẩu trang và mặc trang phục y tế trong suốt quá trình làm xét nghiệm.

- Phân loại đúng rác thải và loại bỏ rác thải ngay sau quá trình thực hiện xét nghiệm.

- Thực hiện kiểm soát điều kiện môi trường theo “Quy trình theo dõi và kiểm soát điều kiện môi trường”.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

4.1.1. Chuẩn bị tiêu bản

- Chuẩn bị hồ sơ xét nghiệm.

- Tách tế bào theo dòng, thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của bộ sinh phẩm sử dụng.

- Nhược trương, cố định màng tế bào, nhỏ huyền dịch tế bào lên lam kính, sấy khô lam kính theo hướng dẫn đi kèm của nhà sản xuất.

4.1.2. Chuẩn bị probe

Chuẩn bị probe đặc hiệu gắn X/Y, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

4.1.3. Lai

- Nhỏ dung dịch probe vào vùng nhỏ tế bào trên tiêu bản sau đó che phủ bằng coverslip.

- Yêu cầu: dung dịch probe dàn đều trên tiêu bản, không có bọt khí.

- Phủ kín coverslip bằng xi măng cao su.

- Đặt vào máy lai, chọn chế độ lai theo hướng dẫn đi kèm của bộ sinh phẩm.

4.1.4. Rửa sau khi lai

- Gỡ bỏ xi măng cao su và coverslip ra khỏi tiêu bản.

- Ngâm và lắc mạnh tiêu bản lần lượt qua các cóng chứa các dung dịch hóa chất (SSC và NP40 pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất) để rửa sạch các probe và hóa chất còn thừa.

4.1.5. Chống mất màu probe

- Nhỏ dung dịch DAPI lên vùng lai để chống mất màu probe và nhuộm nhân tế bào.

- Phủ kín tiêu bản bằng coverslip.

Yêu cầu: dung dịch dàn đều trên tiêu bản và không có bọt khí.

4.2. Phân tích kết quả

Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, với kỹ thuật dual colour FISH, chúng ta sẽ thấy các màu:

- Màu xanh da trời : màu nhân tế bào.

- Màu xanh lá cây: màu của probe.

- Màu đỏ: màu của probe.

Tiến hành nhận định và phân tích kết quả theo hướng dẫn và quy ước của nhà sản xuất đi kèm theo từng loại probe tương ứng, từ đó xác định tỷ lệ tế bào mang NST giới tính XX/XY theo từng dòng tế bào.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả theo quy trình liên quan, ghi vào biểu mẫu có liên quan đến quy trình và lưu hồ sơ xét nghiệm.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Yêu cầu nội kiểm chất lượng: Thực hiện nội kiểm 01 lần/tuần. Khi phân tích kết quả phải có tín hiệu rõ ràng, không bị nhiễu.

- Yêu cầu ngoại kiểm (không bắt buộc): Thực hiện ngoại kiểm/ so sánh liên phòng tối thiểu 1 lần/1 năm, thời gian ngoại kiểm/ so sánh liên phòng ấn định theo chương trình của đơn vị tổ chức ngoại kiểm chất lượng.

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Emanuela VV and Joanna MB. FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique. BioTechniques. 2008; 45:4, 385-409.

2. Ruth BP, Kent MR. Application of fluorescence in situ hybridization (FISH) techniques to fish genetics: a review. Aquaculture. 1996; 140:3, 197-216

3. Małgorzata W, Elżbieta K, Katarzyna L, Bartosz B. Hematological methods in FISH - Not only for beginners. Aquaculture. 2022; 547. 737498.

4. Fazio F. FISH hematology analysis as an important tool of aquaculture: a review. Aquaculture. 2019 Feb 1;500:237-42.

5. Grant KR. FISH hematology and associated disorders. Veterinary Clinics: Exotic Animal Practice. 2015 Jan 1;18(1):83-103.

6. Turkiewicz D, Gorczynska E, Toporski J et al. Monitoring of hematopoietic chimerism after sex-mismatched allogeneic stem cell transplantation (alloSCT) by dual-color FISH analysis of X and Y chromosomes. Leukemia research. 2003 Nov 1;27(11):993-8.

7. Ruiz AD, Chauffaille MD, Alves ST, Oliveira JS. Prevalence of chimerism after non-myeloablative hematopoietic stem cell transplantation. Sao Paulo Medical Journal. 2009;127:251-8.

10. XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT PCR

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Xét nghiệm gen bằng kỹ thuật PCR nhằm phát hiện đột biến điểm hoặc mất/thêm đoạn nhỏ hoặc chèn đoạn, lặp đoạn… trên 1 gen/vùng gen đã được xác định, phục vụ cho chẩn đoán, tiên lượng và điều trị bệnh.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

1.2.1. Định nghĩa

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho trình tự đích.

1.2.2. Nguyên lý

Tách DNA tổng số dựa trên nguyên tắc phá vỡ màng tế bào, màng nhân bằng các phương pháp vật lý, hóa học để giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA, và thu nhận lại DNA tinh sạch bằng hóa chất phù hợp.

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) được thực hiện dựa trên nguyên tắc bổ sung và nhờ hoạt động của enzyme polymerase.

Dựa vào đặc tính cấu trúc của các axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác dụng của điện trường không đổi chúng sẽ di chuyển về cực dương. Tốc độ di chuyển của chúng trên bản thạch agarose phụ thuộc vào kích thước DNA và nồng độ bản thạch.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 02 người.

2.2. Vật tư

2.2.1. Dụng cụ

- Đầu côn thường và đầu côn có phin lọc (1000 µL, 200 µL, 100 µL, 10 µL...).

- Ống ly tâm 1,5-2 mL; ống PCR các thể tích (0,2-0,5 mL…).

- Khay giữ mẫu các loại (24-48 vị trí…): khay giữ lạnh, khay giữ ống 0,5 mL-2mL-15mL-50mL; Bàn thí nghiệm; tủ đựng hóa chất; hộp lưu mẫu; giấy lau máy và giấy lau tay.

- Ống đựng bệnh phẩm (ống chống đông EDTA, ống đựng mẫu vô trùng…); găng tay; khẩu trang; mũ giấy; băng dính, sát khuẩn tay nhanh.

- Chi phí khác: chi phí phần mềm nội bộ của bệnh viện, chi phí hiệu chuẩn trang thiết bị hoặc chi phí đánh giá ISO (nếu có)…

2.2.2. Hóa chất/sinh phẩm

- Hóa chất dùng chung: nước không chứa Nuclease; ethanol 100%.

- Bộ mẫu chứng gồm mẫu chứng không có đột biến, mẫu chứng âm và dương các loại (nếu có).

- Hóa chất tách DNA: kit tách DNA tổng số, ethanol 100% và 70%.

- Hóa chất PCR: hỗn hợp hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR (PCR Master mix…) hoặc enzym (Taq DNA Polymerase…); hỗn hợp 4 loại nucleotid (dNTPs Mix…); mồi xuôi và mồi ngược (50 nmol/ống…).

- Hóa chất điện di: thạch điện di (agarose); chất nhuộm DNA) (nồng độ 5X/6X/10X…); dung dịch đêm điện di; thuốc nhuộm DNA (Ethidium Bromide (10mg/mL…); thang đo DNA (1 kb, 100 bp…); nước cất 2 lần.

- Bảo quản theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.3. Trang thiết bị

- Pipet các thể tích: 0,1-1 µL; 1-10 µL; 1-20 µL; 10-200 µL; 0,1-1 mL.

- Tủ sạch/Tủ ATSH cấp 1/Tủ ATSH cấp 2, Tủ hút hóa chất.

- Máy luân nhiệt PCR 96 giếng, máy tách DNA tự động; máy quang phổ đo DNA/RNA, hệ thống điện di, hệ thống chụp ảnh gel điện di kèm phần mềm; Máy ly tâm thường; máy ly tâm lạnh.

- Tủ lạnh và tủ âm các loại (-20°C; -40°C; -80°C…).

- Thiết bị phụ trợ: máy lắc; tủ ổn nhiệt khô; bể ổn nhiệt nước; nồi khử trùng ướt; tủ sấy khô; cân điện tử; lưu điện; nhiệt ẩm kế; nhiệt kế; máy in ảnh; máy in tem mã vạch.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Loại mẫu bệnh phẩm: máu ngoại vi; dòng tế bào dịch ối sau nuôi cấy; các bệnh phẩm khác: nước bọt, niêm mạc má, mẫu u, gai rau, máu cuống rốn, mẫu u tươi, DNA tổng số, sản phẩm PCR.

- Tiêu chuẩn mẫu bệnh phẩm:

+ Máu ngoại vi: 0,5-2 mL, đựng trong ống EDTA vô trùng.

+ Các bệnh phẩm khác: đựng trong ống đựng bệnh phẩm vô trùng.

+ DNA tổng số, sản phẩm PCR: lượng DNA tối thiểu 10 ng/µL.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Kiểm tra phiếu chỉ định: kiểm tra thông tin theo quy định.

- Kiểm tra ống đựng bệnh phẩm: kiểm tra thông tin theo quy định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật

6,2 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Phòng xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử.

3. AN TOÀN

- Đảm bảo nguyên tắc an toàn sinh học: mặc áo vô trùng, đeo khẩu trang, kính bảo hộ, mũ bảo hộ, găng tay khi thực hiện xét nghiệm.

- Đảm bảo an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất hóa chất, thiết bị.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Chuẩn bị chung cho các bước thực hiện xét nghiệm:

+ Hóa chất, tiêu hao, dụng cụ và đăng kí sử dụng máy

+ Ghi tên người bệnh/mã số người bệnh lên các ống xét nghiệm.

+ Tính tổng số hóa chất cần pha để thực hiện 1 lần xét nghiệm hoặc xét nghiệm cho 1 mẫu bệnh phẩm.

4.1.1. Tách DNA tổng số

DNA tổng số có thể thực hiện theo 2 cách: tách bằng kit thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất và tách thủ công sử dụng các loại hóa chất tương đương như enzyme protease, hóa chất tẩy rửa mạnh (SDS…), dung dịch đệm ly giải, cồn.... Các bước thực hiện như sau:

- Biến tính và phân giải protein: thêm lượng mẫu cần thiết vào ống đã chứa enzyme hoặc hóa chất tương đương nhằm phá màng tế bào và màng nhân; bổ sung dung dịch đệm (nếu cần), trộn đều và ủ ở nhiệt độ phù hợp.

- Loại bỏ protein: protein sau biến tính sẽ được kết tủa và phân lớp hoặc giữ lại trên cột lọc.

- Thu axit nucleic: sử dụng cồn hoặc hóa chất tương đương để tủa DNA hoặc hòa tan DNA và được thu lại bằng cách ly tâm ở tốc độ phù hợp. DNA được hòa tan trong dung dịch phù hợp (nước khử enzyme hoặc dung dịch tương đương) và bảo quản ở nhiệt độ -20°C.

- Kiểm tra chất lượng DNA tổng số bằng điện di hoặc quang phổ kế.

4.1.2. Thực hiện kỹ thuật PCR

- Chuẩn bị phiếu theo dõi thực hiện xét nghiệm (nếu có), rã đông hóa chất cần dùng.

- Chuẩn bị bộ mẫu cần chạy (ở nhiệt độ phòng) bao gồm: mẫu chứng âm; mẫu chứng dương (nếu có); mẫu trắng; mẫu bệnh phẩm.

- Tính số phản ứng cần chuẩn bị và thể tích hóa chất cần pha cho 2 lần thực hiện xét nghiệm PCR gồm người bệnh và mẫu nội kiểm. Thể tích cho mỗi phản ứng gồm các thành phần sau:

- Chia đều hóa chất PCR ra ống ống PCR 0,2 ul và bổ sung DNA tổng số của người bệnh và các mẫu chứng cần thiết vào ống PCR, chuyển các ống PCR vào máy luân nhiệt PCR và chạy theo chương trình nhiệt của từng xét nghiệm.

4.1.3. Điện di sản phẩm PCR

- Chuẩn bị dung dịch đệm 1X.

- Chuẩn bị bản thạch agarose với nồng độ thích hợp.

+ Lắp lược vào các khay đổ thạch và điều chỉnh khay cân bằng.

+ Cân lượng thạch agarose cần thiết, và bổ sung dung dịch đệm với thể tích tương ứng với nồng độ thạch cần dùng và đun nóng dung dịch thạch bằng lò vi sóng cho đến khi toàn bộ agarose trong dung dịch tan hoàn toàn.

+ Làm nguội dung dịch đến khoảng 50-70°C và thêm 5µL thuốc nhuộm trong 100mL dung dịch agarose, lắc đều (trường hợp không bổ sung thuốc nhuộm DNA, sau điện di bản thạch sẽ ngâm trong dung dịch thuốc nhuộm DNA) rồi đổ toàn bộ dung dịch thạch agarose vào khuôn đã được cài sẵn lược, để bản thạch nguội ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30 phút.

- Điện di sản phẩm PCR

+ Khi thạch nguội, từ từ nhấc lược ra khỏi khuôn, và đặt bản thạch vào bể điện di.

+ Đổ dung dịch đệm 1X vào bể điện di sao cho dung dịch đệm cao hơn mặt bản thạch khoảng 2-5 mm.

+ Dùng pipet hút l thể tích thuốc nhuộm và trộn đều với 5 thể tích sản phẩm PCR. Sau đó, dùng pipet hút toàn bộ mẫu và nhỏ mẫu vào từng giếng trên bản thạch.

+ Đậy nắp bể điện di và cắm điện cực vào nguồn điện di và điện di mẫu trong khoảng 30-50 phút với điện thế 90-200V.

- Chụp ảnh sản phẩm điện di: đặt bản thạch vào máy chụp ảnh gel, đóng nắp, bật đèn UV và chụp theo hướng dẫn của nhà sản xuất; lưu hình ảnh điện di hoặc in ảnh (nếu cần); vệ sinh các dụng cụ điện di bằng cồn 70°C.

4.2. Nhận định kết quả

4.2.1. Xem xét kết quả QC

a. Tách DNA

Lượng DNA tổng số được đo trên máy quang phổ đo DNA/RNA tại bước sóng OD_260/280nm ≥ 10 ng và độ tinh sạch DNA trong khoảng 1,8-2,0.

b. Quá trình PCR

- Sản phẩm PCR sợi đôi được kiểm tra bằng cách điện di trên thạch agarose, nồng độ phù hợp, tùy thuộc vào đặc trưng của các gen khuếch đại trong cùng một ống nghiệm.

- Mẫu chứng nội kiểm, mẫu bệnh phẩm xuất hiện băng có kích thước đúng kích thước lý thuyết.

c. Điện di

- Cách thức phân tích kết quả: vị trí của DNA được xác định dựa vào thang DNA chuẩn để ước lượng kích thước của sản phẩm PCR. Băng điện di trên bản thạch phát hiện thấy dưới ánh sáng UV.

- Các băng điện di trên thang DNA chuẩn được sử dụng để đối chiếu với kích thước sản phẩm PCR của người bệnh và nhận định kết quả chỉ khi đạt được độ sáng rõ ràng, băng không bị đứt gãy.

4.2.2. Đọc kết quả và nhận định kết quả

a. Đọc kết quả

- Kết quả được phân tích độc lập bởi 2 nhân viên khác nhau.

- So sánh kích thước sản phẩm PCR của người bệnh với mẫu chứng và đưa ra kết luận kiểu gen hoặc loại đột biến gen.

- Ghi nhận kết quả phân tích vào hồ sơ tương ứng của người bệnh.

b. Nhận định kết quả

- Danh pháp của các biến thể được viết theo hướng dẫn của HGVS.

- Nhận định kiểu gen tương ứng (đồng hợp tử, dị hợp tử hoặc không phát hiện đột biến…).

4.2.3. Phiên giải và báo cáo kết quả

- Phiên giải kết quả giải trình tự theo hướng dẫn của ACMG.

- Báo cáo kết quả theo quy trình liên quan.

4.2.4. Biện luận kết quả cho những trường hợp bất thường

- Đối chiếu kết quả kiểu gen và kiểu hình theo quy định.

- Tư vấn di truyền hoặc thực hiện thêm xét nghiệm nếu cần.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

4.3.1. Trả kết quả

- Báo cáo kết quả xét nghiệm được thực hiện theo các quy trình liên quan, lưu hồ sơ và ghi vào biểu mẫu cần thiết và lưu hồ sơ xét nghiệm.

- Kết quả xét nghiệm cần được kiểm tra chéo, phê duyệt trước khi trả.

4.3.2. Lưu trữ hồ sơ

- Hồ sơ xét nghiệm được lưu trữ theo quy định.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật

5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Giá trị báo động/nguy hiểm:

- Lượng DNA tổng số < 1ng/µL, độ tinh sạch (OD_260/280nm) ngoài khoảng từ 1,8-2,0.

- PCR của mẫu nội kiểm, mẫu trắng không đạt tiêu chuẩn khi xuất hiện các băng có kích thước khác với kích thước theo lý.

- Tiêu chuẩn đánh giá:

+ Phân tích kết quả được thực hiện khi mẫu nội kiểm đạt yêu cầu (đủ số băng, đúng kích thước).

+ Mẫu trắng không có băng và thang chuẩn phù hợp, tách đều.

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Li MM, Cottrell CE, Pullambhatla M, et al. 2023. “Assessments of Somatic Variant Classification Using the Association for Molecular Pathology/American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Guidelines: A Report from the Association for Molecular Pathology”. J Mol Diagn. 25(2):69-86.

2. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 2001. "Molecular Cloning: A laboratary manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.

3. Trần Đức Phấn và cs. 2021. “Di truyền Y học”. Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam.

4. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. 1988. “Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science”. 239(4839):487-91.

5. Mullis KB. 1990. “Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction”. Ann Biol Clin (Paris). 48(8):579-82.

6. Richards S, Aziz N, Bale S, Bick D, Das S, Gastier-Foster J, Grody WW, Hegde M, Lyon E, Spector E, Voelkerding K, Rehm HL; ACMG Laboratory Quality Assurance Committee. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015 May;17(5):405-24. doi: 10.1038/gim.2015.30. Epub 2015 Mar 5. PMID: 25741868; PMCID: PMC4544753.

7. Tiêu chuẩn ISO 15189:2022.

8. Hướng dẫn HGSVS: https://hgvs-nomenclature.org/

11. XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Xét nghiệm gen bằng kỹ thuật Multiplex PCR nhằm phát hiện cùng lúc nhiều biến thể đã biết trên cùng 1 gen hoặc nhiều gen đã biết trong cùng 1 phản ứng nhằm phục vụ chẩn đoán, điều trị và tiên lượng bệnh. Ví dụ bệnh di truyền, ung thư...

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

1.2.1. Định nghĩa

Kỹ thuật Multiplex PCR là kỹ thuật dựa trên phương pháp PCR nhưng sử dụng cùng lúc nhiều cặp mồi khác nhau trong cùng một phản ứng, nhờ đó có thể khuếch đại nhiều sản phẩm mong muốn có độ lớn khác nhau và nhận biết được nhờ điện di trên agarose có nồng độ cao.

1.2.2. Nguyên lý

Tách DNA tổng số dựa trên nguyên tắc phá vỡ màng tế bào, màng nhân bằng các phương pháp vật lý, hóa học để giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA, thu nhận lại DNA tinh sạch bằng hóa chất phù hợp.

Kỹ thuật Multiplex PCR (Multiplex polymerase chain reaction) sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau để khuếch đại các trình tự mục tiêu khác nhau trong cùng một phản ứng. Để thiết kế được phản ứng Multiplex PCR đòi hỏi các cặp mồi sử dụng phải có cùng nhiệt độ bắt cặp và các cặp mồi này cũng không được bắt cặp với nhau hay bắt cặp chéo lẫn nhau.

Dựa vào đặc tính cấu trúc của các axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác dụng của điện trường không đổi chúng sẽ di chuyển về cực dương. Tốc độ di chuyển của chúng trên bản thạch agarose phụ thuộc vào kích thước DNA và nồng độ bản thạch.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01 người;

- Kỹ thuật y hoặc tương đương: 02 người.

2.2. Vật tư

2.2.1. Dụng cụ