Quyết định 3123/QĐ-BYT năm 2025 về Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Giải phẫu bệnh” do Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành

QUYẾT ĐỊNH

VỀ VIỆC BAN HÀNH TÀI LIỆU CHUYÊN MÔN “HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT VỀ GIẢI PHẪU BỆNH”

BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ

Căn cứ Luật Khám bệnh, chữa bệnh năm 2023;

Căn cứ Nghị định số 42/2025/NĐ-CP ngày 27/02/2025 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Y tế;

Căn cứ Thông tư số 23/2024/TT-BYT ngày 18 tháng 10 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành Danh mục kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh;

Căn cứ Quyết định số 621/QĐ-BYT ngày 14 tháng 03 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc thành lập Hội đồng chuyên môn nghiệm thu “Hướng dẫn quy trình chuyên môn kỹ thuật về Giải phẫu bệnh”;

Căn cứ Biên bản họp ngày 08 tháng 08 năm 2025 của Hội đồng chuyên môn nghiệm thu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Giải phẫu bệnh”; Công văn số 3270/BVK-KHTH ngày 25 tháng 08 năm 2025 của Bệnh viện K về việc hoàn thiện Hướng dẫn Quy trình chuyên môn kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh;

Theo đề nghị của Cục trưởng Cục Quản lý Khám, chữa bệnh.

QUYẾT ĐỊNH:

Điều 1. Ban hành kèm theo Quyết định này Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Giải phẫu bệnh” – Tập 1, gồm 69 quy trình kỹ thuật (Tài liệu chuyên môn kèm theo).

Điều 2. Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Giải phẫu bệnh” được áp dụng tại các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh. Dựa trên tài liệu chuyên môn này, các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh có trách nhiệm xây dựng quy trình kỹ thuật về Giải phẫu bệnh phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám bệnh, chữa bệnh.

Điều 3. Quyết định này có hiệu lực kể từ ngày 01/7/2026.

Điều 4. Các ông, bà: Chánh Văn phòng Bộ; Cục trưởng Cục Quản lý Khám, chữa bệnh; Cục trưởng, Vụ trưởng các Cục, Vụ thuộc Bộ Y tế; Giám đốc các bệnh viện trực thuộc Bộ Y tế; Giám đốc Sở Y tế các tỉnh, thành phố trực thuộc trung ương; Thủ trưởng Y tế các ngành và các cơ quan, đơn vị liên quan chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này./.

HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT

VỀ GIẢI PHẪU BỆNH

(TẬP 1)

(Ban hành kèm theo Quyết định số 3123/QĐ-BYT ngày 02 tháng 10 năm 2025 của Bộ trưởng Bộ Y tế)

LỜI NÓI ĐẦU

Ngành Giải phẫu bệnh đóng vai trò hết sức quan trọng trong Hệ thống y tế hiện đại, được xem là tiêu chuẩn vàng trong để chẩn đoán xác định nhiều bệnh, đặc biệt là các bệnh lý u và ung thư. Việc chuẩn hóa các quy trình chuyên môn kỹ thuật trong lĩnh vực này là hết sức cần thiết nhằm đảm bảo chất lượng chẩn đoán, thống nhất trong thực hành, nâng cao hiệu quả điều trị và an toàn cho người bệnh.

Trên cơ sở các tiến bộ khoa học kỹ thuật, cập nhật theo các hướng dẫn quốc tế và phù hợp với điều kiện thực tiễn tại Việt Nam, Bộ Y tế tổ chức xây dựng tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh – Tập 1”. Tài liệu này tổng hợp, hệ thống hóa các quy trình kỹ thuật từ cơ bản đến chuyên sâu, áp dụng trong hoạt động chuyên môn tại các cơ sở khám chữa bệnh có triển khai các xét nghiệm Giải phẫu bệnh.

Tài liệu này là cơ sở quan trọng cho các bác sĩ, kĩ thuật viên và nhân viên y tế trong việc thực hành các kỹ thuật về Giải phẫu bệnh một cách khoa học, chính xác và hiệu quả. Đồng thời, đây cũng là căn cứ để các cơ sở y tế xây dựng quy trình nội bộ, phục vụ công tác đào tạo, kiểm tra và đánh giá chất lượng chuyên môn.

Bộ Y tế trân trọng cảm ơn các chuyên gia, các nhà khoa học, các đơn vị y tế và các cá nhân đã đóng góp nhiều công sức trong quá trình xây dựng tài liệu này.

QUYẾT ĐỊNH

VỀ VIỆC BAN HÀNH TÀI LIỆU CHUYÊN MÔN “HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT VỀ GIẢI PHẪU BỆNH”

BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ

Căn cứ Luật Khám bệnh, chữa bệnh năm 2023;

Căn cứ Nghị định số 42/2025/NĐ-CP ngày 27/02/2025 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Y tế;

Căn cứ Thông tư số 23/2024/TT-BYT ngày 18 tháng 10 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành Danh mục kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh;

Căn cứ Quyết định số 621/QĐ-BYT ngày 14 tháng 03 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc thành lập Hội đồng chuyên môn nghiệm thu “Hướng dẫn quy trình chuyên môn kỹ thuật về Giải phẫu bệnh”;

Căn cứ Biên bản họp ngày 08 tháng 08 năm 2025 của Hội đồng chuyên môn nghiệm thu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Giải phẫu bệnh”; Công văn số 3270/BVK-KHTH ngày 25 tháng 08 năm 2025 của Bệnh viện K về việc hoàn thiện Hướng dẫn Quy trình chuyên môn kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh;

Theo đề nghị của Cục trưởng Cục Quản lý Khám, chữa bệnh.

QUYẾT ĐỊNH:

Điều 1. Ban hành kèm theo Quyết định này Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Giải phẫu bệnh” – Tập 1, gồm 69 quy trình kỹ thuật (Tài liệu chuyên môn kèm theo).

Điều 2. Tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật về Giải phẫu bệnh” được áp dụng tại các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh. Dựa trên tài liệu chuyên môn này, các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh có trách nhiệm xây dựng quy trình kỹ thuật về Giải phẫu bệnh phù hợp với điều kiện thực tế của cơ sở khám bệnh, chữa bệnh.

Điều 3. Quyết định này có hiệu lực kể từ ngày 01/7/2026.

Điều 4. Các ông, bà: Chánh Văn phòng Bộ; Cục trưởng Cục Quản lý Khám, chữa bệnh; Cục trưởng, Vụ trưởng các Cục, Vụ thuộc Bộ Y tế; Giám đốc các bệnh viện trực thuộc Bộ Y tế; Giám đốc Sở Y tế các tỉnh, thành phố trực thuộc trung ương; Thủ trưởng Y tế các ngành và các cơ quan, đơn vị liên quan chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này./.

HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT

VỀ GIẢI PHẪU BỆNH

(TẬP 1)

(Ban hành kèm theo Quyết định số 3123/QĐ-BYT ngày 02 tháng 10 năm 2025 của Bộ trưởng Bộ Y tế)

LỜI NÓI ĐẦU

Ngành Giải phẫu bệnh đóng vai trò hết sức quan trọng trong Hệ thống y tế hiện đại, được xem là tiêu chuẩn vàng trong để chẩn đoán xác định nhiều bệnh, đặc biệt là các bệnh lý u và ung thư. Việc chuẩn hóa các quy trình chuyên môn kỹ thuật trong lĩnh vực này là hết sức cần thiết nhằm đảm bảo chất lượng chẩn đoán, thống nhất trong thực hành, nâng cao hiệu quả điều trị và an toàn cho người bệnh.

Trên cơ sở các tiến bộ khoa học kỹ thuật, cập nhật theo các hướng dẫn quốc tế và phù hợp với điều kiện thực tiễn tại Việt Nam, Bộ Y tế tổ chức xây dựng tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh – Tập 1”. Tài liệu này tổng hợp, hệ thống hóa các quy trình kỹ thuật từ cơ bản đến chuyên sâu, áp dụng trong hoạt động chuyên môn tại các cơ sở khám chữa bệnh có triển khai các xét nghiệm Giải phẫu bệnh.

Tài liệu này là cơ sở quan trọng cho các bác sĩ, kĩ thuật viên và nhân viên y tế trong việc thực hành các kỹ thuật về Giải phẫu bệnh một cách khoa học, chính xác và hiệu quả. Đồng thời, đây cũng là căn cứ để các cơ sở y tế xây dựng quy trình nội bộ, phục vụ công tác đào tạo, kiểm tra và đánh giá chất lượng chuyên môn.

Bộ Y tế trân trọng cảm ơn các chuyên gia, các nhà khoa học, các đơn vị y tế và các cá nhân đã đóng góp nhiều công sức trong quá trình xây dựng tài liệu này.

Trong quá trình sử dụng, nếu có khó khăn, vướng mắc hoặc góp ý hoàn thiện, đề nghị các đơn vị phản hồi về Bộ Y tế để kịp thời cập nhật, bổ sung.

Trân trọng !

NGUYÊN TẮC ÁP DỤNG HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT

1. Hướng dẫn quy trình kỹ thuật được xây dựng và ban hành theo từng chương, chuyên ngành; bao gồm các quy định về chỉ định, chống chỉ định, thận trọng, chuẩn bị thực hiện kỹ thuật, đến các bước thực hiện theo trình tự từ khi bắt đầu đến khi kết thúc thực hiện kỹ thuật.

2. Tài liệu chuyên môn Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh – Tế bào; Quyển 1 được xây dựng và ban hành cho các kỹ thuật có trong Phụ lục số 02, Thông tư số 23/2024/TT-BYT ngày 18 tháng 10 năm 2024 của Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành danh mục kỹ thuật trong khám bệnh, chữa bệnh. Tài liệu chuyên môn này được áp dụng tại các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh từ ngày 01 tháng 07 năm 2026.

3. Quy định về thời gian thực hiện kỹ thuật, nhân lực (chức danh chuyên môn nghề nghiệp, số lượng nhân lực), thuốc, thiết bị y tế... trong Hướng dẫn quy trình kỹ thuật do Bộ Y tế ban hành dựa trên tính phổ biến, thường quy thực hiện tại cơ sở khám bệnh, chữa bệnh. Trong thực tế triển khai, căn cứ diễn biến lâm sàng, tình trạng người bệnh, căn cứ vào điều kiện thực tế về hạ tầng, thiết bị, nhân lực các đơn vị quy định thời gian tương ứng với điều kiện của đơn vị mình trong hướng dẫn quy trình của từng đơn vị để làm căn cứ thực hiện.

4. Chỉ sử dụng các thuốc, thiết bị y tế... được cấp phép theo quy định hiện hành.

5. Trong quá trình triển khai áp dụng Hướng dẫn quy trình kỹ thuật, nếu thấy các bất cập hoặc nhu cầu cần sửa đổi, bổ sung, các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh chủ động cập nhật và ban hành Hướng dẫn quy trình kỹ thuật, đồng thời báo cáo, đề xuất Bộ Y tế (Cục QLKCB) về việc cập nhật để ban hành áp dụng trong cả nước.

MỤC LỤC

CHỮ VIẾT TẮT

PHẦN I. CÁC QUY TRÌNH KỸ THUẬT TẾ BÀO HỌC

1. CHỌC HÚT KIM NHỎ MỘT VỊ TRÍ TỔN THƯƠNG HOẶC U CỦA DA, DƯỚI DA VÀ CÁC CƠ QUAN CÓ VỊ TRÍ NÔNG

2. CHỌC HÚT KIM NHỎ MỘT VỊ TRÍ TỔN THƯƠNG HOẶC U CỦA DA, DƯỚI DA VÀ CÁC CƠ QUAN CÓ VỊ TRÍ NÔNG DƯỚI HƯỚNG DẪN CỦA SIÊU ÂM

3. CHỌC HÚT KIM NHỎ CÁC TỔN THƯƠNG HOẶC U Ở VỊ TRÍ SÂU (Ổ BỤNG, TRUNG THẤT,…) DƯỚI HƯỚNG DẪN CỦA SIÊU ÂM

4. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ BÀO HỌC CÁC BỆNH PHẨM CHỌC HÚT KIM NHỎ, ÁP LAM

5. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ BÀO HỌC DỊCH CƠ THỂ

6. XÉT NGHIỆM TẾ BÀO HỌC KẾT MẠC, GIÁC MẠC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ÁP (Impression Cytology – IC)

7. XÉT NGHIỆM TẾ BÀO HỌC KẾT MẠC, GIÁC MẠC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NẠO (Scraping cytology on the conjunctive and cornea)

8. QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ BÀO HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM PAPANICOLAOU

9. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HAI MÀU HEMATOXYLIN - EOSIN TIÊU BẢN TẾ BÀO HỌC

10. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ BÀO HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẾ BÀO HỌC CHẤT LỎNG (LIQUID – BASED CYOTLOGY)

11. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ BÀO TRONG CÁC LOẠI DỊCH CƠ THỂ BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẾ BÀO HỌC CHẤT LỎNG (Non Gyn)

13. QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM TẾ BÀO TÌM TINH THỂ URAT QUA KÍNH HIỂN VI PHÂN CỰC PHẦN II. CÁC QUY TRÌNH NHUỘM MÔ BỆNH HỌC – TẾ BÀO

28. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ĐỎ CONGO KIỀM (THEO PUCHTLER 1962)

29. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM XANH ALCIAN

30. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM 3 MÀU CỦA MASSON (1929)

31. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MAY – GRUNWALD – GIEMSA CHO TUỶ XƯƠNG

32. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM SOUDAN III HOẶC IV

33. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM OIL RED O TRONG DUNG DỊCH ETHANOL

34. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ĐEN SOUDAN B TRONG DIACETIN

35. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GROCOTT

36. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM XANH PHỔ PERL PHÁT HIỆN ION SẮT

37. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM BẠC WARTHIN – STARY PHÁT HIỆN HELICOBACTER PYLORI

38. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM SẮT CAO

39. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GOMORI CHO SỢI VÕNG

40. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ORCEIN CẢI BIÊN THEO SHIKATA PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN HbsAg

41. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ORCEIN PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN VIÊM GAN B (HbsAg) TRONG MÔ GAN

42. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MUCICARMIN

43. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MAY – GRUNWALD – GIEMSA

44. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM XANH TOLUIDINE

45. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM XANH LUXOL/NISEELL

46. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM

47. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM NGẤM BẠC XEM DƯỚI KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ QUÉT

48. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM TRICHROME BLUE

49. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GOMORI METHENAMINE SILVER

50. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM SẮT

51. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM CHẤT ĐỒNG

52. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM BẠC CHO THẬN BẰNG PHƯƠNG PHÁP XANH JONES

53. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM PAS (Periodic Acid Schiff)

54. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM PERIODIC ACID SCHIFF DIASTATE (PAS – D)

55. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HEMATOXYLIN EOSIN TRÊN TIÊU BẢN MÔ

56. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GIEMSA TRÊN MẢNH CẮT MÔ PHÁT HIỆN HP

57. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM PAS KẾT HỢP XANH ALCIAN

58. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM DIFF - QUICK

59. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MÔ BỆNH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GIEMSA

60. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MÔ BỆNH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GOMORI

61. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MÔ BỆNH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM RETICULINE

62. NHUỘM ZIEHL – NEELSEN TÌM VI KHUẨN LAO TRONG TỔ CHỨC

63. CHUẨN BỊ MẪU MÔ VÀ ĐỌC TỔN THƯƠNG TRÊN KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ QUÉT

64. CHUẨN BỊ MẪU MÔ VÀ ĐỌC TỔN THƯƠNG TRÊN KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ TRUYỀN QUA

PHẦN III. CÁC QUY TRÌNH

65. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA MÔ MIỄN DỊCH CHO MỘT DẤU ẤN

66. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA MÔ MIỄN DỊCH TỰ ĐỘNG CHO MỖI MỘT DẤU ẤN BẰNG MÁY

67. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA MÔ MIỄN DỊCH CHO MỖI DẤU ẤN TRONG ĐIỀU TRỊ ĐÍCH

68. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA MÔ MIỄN DỊCH DẤU ẤN ALK

69. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA MÔ MIỄN DỊCH CHO MỖI DẤU ẤN TRONG ĐIỀU TRỊ MIỄN DỊCH

70. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA MÔ MIỄN DỊCH DẤU ẤN PD-L1 TRONG ĐIỀU TRỊ MIỄN DỊCH

71. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA MÔ MIỄN DỊCH ĐỒNG THỜI TỪ HAI DẤU ẤN TRỞ LÊN TRÊN CÙNG MỘT PHIẾN ĐỒ HOẶC MỘT TIÊU BẢN

72. XÉT NGHIỆM HOÁ TẾ BÀO MIỄN DỊCH TRÊN PHIẾN ĐỒ HOẶC MỘT TIÊU BẢN CHO MỘT DẤU ẤN

73. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN HÓA MIỄN DỊCH ĐỒNG THỜI TỪ HAI DẤU ẤN TRỞ LÊN TRÊN CÙNG MỘT PHIẾN ĐỒ HOẶC TIÊU BẢN

75. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN

76. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG TRỰC TIẾP PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN

77. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ

78. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG TRỰC TIẾP CHO BỘ 6 KHÁNG THỂ

79. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP ĐỊNH LƯỢNG HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ

80. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP TÁCH MUỐI PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ

81. XÉT NGHIỆM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI TẠI CHỖ GẮN BẠC HAI MÀU (DUAL-ISH)

82. XÉT NGHIỆM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI TẠI CHỖ (IN SITU HYBRIDIRATION: ISH)

83. XÉT NGHIỆM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI TẠI CHỖ GẮN MÀU (CISH)

84. XÉT NGHIỆM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI TẠI CHỖ GẮN HUỲNH QUANG (FISH)

DANH MỤC KỸ THUẬT

CHỮ VIẾT TẮT

PHẦN I. CÁC QUY TRÌNH KỸ THUẬT TẾ BÀO HỌC

1. CHỌC HÚT KIM NHỎ MỘT VỊ TRÍ TỔN THƯƠNG HOẶC U CỦA DA, DƯỚI DA VÀ CÁC CƠ QUAN CÓ VỊ TRÍ NÔNG

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả và hướng dẫn cách thực hiện lấy bệnh phẩm tế bào bằng kĩ thuật chọc hút kim nhỏ của các tổn thương hoặc các khối u da, dưới da hoặc các cơ quan ở vị trí nông (như tuyến vú, hạch, tuyến nước bọt, tuyến giáp,…); không có hướng dẫn của các thiết bị chẩn đoán hình ảnh; nhằm lấy đúng vùng tổn thương, lấy được bệnh phẩm đủ và phù hợp cho xét nghiệm tế bào học cũng như các xét nghiệm khác (hoá tế bào, khối tế bào,…).

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Chọc hút tế bào bằng kim nhỏ (FNA- Fine Needle Aspiration) là kỹ thuật sử dụng kim tiêm, đưa kim qua da vào vùng tổn thương, hút tế bào theo phương pháp mao dẫn hoặc hút với áp lực âm (có gắn bơm tiêm) để các tế bào từ mô đi vào trong kim, bơm chất dịch lấy được trên lam kính và/hoặc vào dung dịch bảo quản phù hợp để phục vụ xét nghiệm chẩn đoán tế bào học cũng như các xét nghiệm khác.

Tế bào thu được sau chọc hút để thực hiện xét nghiệm tế bào nhằm xác định các tổn thương viêm hoặc các tổn thương u lành, u ác tính hoặc thực hiện các xét nghiệm khác như thực hiện kỹ thuật khối tế bào, xét nghiệm các dấu ấn sinh học,...

2. CHỈ ĐỊNH

- Tổn thương u có thể sờ thấy bằng khám lâm sàng.

3. CHỐNG CHỈ ĐỊNH

- Người bệnh có bệnh nặng toàn thân: suy tim, suy thận, suy hô hấp;

- Người bệnh có rối loạn đông máu;

4. THẬN TRỌNG

- Thận trọng với người bệnh có tiền sử động kinh, cao huyết áp,…

- Thận trọng với các tổn thương đang trong giai đoạn viêm, đặc biệt trong viêm cấp hoặc viêm nhiễm nặng tại chỗ.

- Người bệnh quá mức lo lắng, không hợp tác.

5. CHUẨN BỊ

5.1. Người thực hiện

- Nhân lực trực tiếp:

+ Bác sĩ được hướng dẫn hoặc đào tạo kỹ thuật: 01

+ Bác sĩ phụ: 01

+ Kỹ thuật y: 01

- Nhân lực hỗ trợ:

+ Nhân viên hành chính;

+ Hộ lý, nhân viên vệ sinh.

5.2. Thuốc, hoá chất

- Cồn 70 độ sát khuẩn hoặc dung dịch cồn iod. Có thể sử dụng bông có thấm sẵn cồn sát khuẩn (nếu có);

- Dung dịch cố định bệnh phẩm: cồn tuyệt đối,…

- Gel sử dụng trong siêu âm;

- Dung dịch sát khuẩn tay nhanh;

- Dung dịch rửa tay thường quy;

- Nước cất;

- Các thuốc trong hộp chống sốc.

- Thuốc giảm đau bôi hoặc xịt ngoài da.

5.3. Vật tư, dụng cụ

Vật tư tiêu hao:

- Bơm tiêm vô trùng 10ml hoặc 20ml;

- Kim tiêm loại 23G hoặc 27G;

- Lam kính sạch, một đầu mài mờ để ghi thông tin người bệnh;

- Lọ chứa dung dịch cố định để chứa bệnh phẩm;

- Bông khô tiệt trùng;

- Băng dính y tế;

- Găng tay sạch, khẩu trang, mũ y tế;

- Giấy/khăn lau tay;

- Giấy A4; sổ bàn giao bệnh phẩm.

- Bút dạ dầu, bút chì mềm, bút bi;

Dụng cụ:

- Dụng cụ gắn bơm tiêm;

- Pipet nhựa;

- Hộp inox đựng bông cồn, bông khô có nắp đậy;

- Ống inox đựng phanh, kéo;

- Panh thẳng không mấu

- Kéo inox;

- 2 Khay quả đậu đựng dụng cụ, vật tư sạch và vật tư đã sử dụng;

- Hộp đựng bông cồn sát trùng và hộp đựng bông khô tiệt trùng;

- Hộp bằng thép không rỉ đựng bơm, kim tiêm sạch;

- Hộp chống sốc;

- Khay/giá để tiêu bản;

- Hộp vận chuyển bệnh phẩm;

- Tấm phủ vô khuẩn;

- Túi rác thải y tế; túi rác thải thông thường;

- Hộp đựng rác thải sắc nhọn;

- Thùng đựng rác thải y tế (màu vàng) và thông thường (màu xanh).

5.4. Trang thiết bị

- Ống nghe, máy đo huyết áp;

- Máy siêu âm có đầu dò phù hợp;

- Giường làm thủ thuật.

- Xe tiêm 2 tầng đựng dụng cụ.

- Kính hiển vi quang học;

- Máy tính, máy in; máy quét mã vạch.

5.5. Chuẩn bị người bệnh

- Giải thích cho người bệnh hoặc người nhà người bệnh về quy trình thực hiện, mục đích, nguy cơ, lợi ích; để người bệnh yên tâm và hợp tác làm xét nghiệm.

- Khai thác tiền sử bệnh và các triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng.

- Khám người bệnh xác định vị trí vùng cần thực hiện thủ thuật, màu sắc, số lượng, mật độ, kích thước, sự di động.

5.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: Ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân, tên khoa phòng, chẩn đoán, thời gian lấy mẫu, kết quả khám lâm sàng và tiền sử của bệnh nhân.

5.7. Thời gian thực hiện kỹ thuật:

- Thời gian thực hiện kĩ thuật: 20 - 30 phút

5.8. Địa điểm thực hiện kỹ thuật:

- Phòng thủ thuật hoặc phòng xét nghiệm tế bào học.

5.9. Kiểm tra hồ sơ

- Kiểm tra người bệnh: Đánh giá tính chính xác của người bệnh: đúng người bệnh, đúng chẩn đoán, đúng vị trí thực hiện kỹ thuật.

- Thực hiện bảng kiểm an toàn thủ thuật;

- Hướng dẫn bệnh nhân tư thế đảm bảo bộc lộ rõ vùng cần thực hiện thủ thuật và an toàn khi thực hiện. Bộc lộ vị trí cần thực hiện thủ thuật.

6. TIẾN HÀNH QUY TRÌNH KỸ THUẬT

6.1. Thực hiện thủ thuật lấy bệnh phẩm

- Thủ thuật nên thực hiện sau các xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh.

- Giải thích người bệnh về thủ thuật; kiểm tra kết quả chẩn đoán hình ảnh của bệnh nhân để đánh giá chính xác u.

- Hướng dẫn người bệnh nằm hoặc ngồi với tư thế phù hợp với vị trí yêu cầu thực hiện thủ thuật.

- Chuẩn bị dụng cụ thực hiện thủ thuật, chuẩn bị lam kính và/hoặc lọ đựng bệnh phẩm viết tên, tuổi, mã số của bệnh nhân. Sát khuẩn tay trước khi thực hiện thủ thuật.

- Bộc lộ vị trí cần chọc.

- Sát khuẩn vùng cần chọc, phủ sand lỗ.

- (Có thể gây tê vùng da tại chỗ bằng lidocain bôi hoặc xịt ngoài da. Nếu người bệnh dị ứng thuốc tê có thể giải thích để không gây tê. Chờ 1 phút).

- Thực hiện thủ thuật: Cố định vị trí cần chọc bằng 2 ngón tay trái, tay phải cầm bơm tiêm có kim. Đưa kim tiêm chọc hút qua da vào ổ tổn thương. Hút dưới áp lực âm để dịch hoặc tế bào vào trong lòng kim. Rút nhanh kim qua da.

- Có thể hút nhiều vị trí tổn thương nếu u > 1,5cm.

- Sát trùng lại vị trí chọc.

- Băng ép vết chọc.

6.2. Làm phiến đồ (Dàn bệnh phẩm lên lam kính) và cố định bệnh phẩm

- Tháo kim ra khỏi bơm tiêm. Kéo pittông xuống để lấy không khí vào bơm tiêm tạo áp lực. Lắp kim vào bơm tiêm.

- Nhanh chóng bơm dịch trong kim và bơm tiêm ra các lam kính đã ghi sẵn thông tin người bệnh.

- Dùng một lam kính khác dàn bệnh phẩm trên các lam kính có bệnh phẩm để bệnh phẩm được dàn mỏng, đều. Có thể dàn bằng kim nếu bệnh phẩm ít.

- Để khô lam kính tự nhiên trong khoảng 10 phút. Có thể sử dụng tủ ấm hoặc máy sấy để làm khô bệnh phẩm nếu không khí có độ ẩm cao.

- Cố định lam kính bệnh phẩm bằng dung dịch cố định. Nên cố định ngay sau khô, nếu cố định kém tế bào thoái hoá và không đánh giá đúng tổn thương.

- Nếu có các xét nghiệm có thể bơm 1 phần bệnh phẩm vào lọ đựng bệnh phẩm có sẵn dung dịch bảo quản. Nắp lọ kín tránh tràn đổ.

6.3. Đánh giá bệnh phẩm về đại thể

- Yêu cầu kết quả của lam kính chứa bệnh phẩm: Dàn đều, mỏng, ít máu.

- Lam kính bệnh phẩm không đạt:

+ Quá nhiều hồng cầu: không đổi hướng mũi kim khi kim đã đâm vào mô để tránh chảy máu khi chọc hoặc thấy nhiều máu có thể chọc thêm 1 vị trí khác nếu u đủ lớn.

+ Lam kính bệnh phẩm dàn quá dày hoặc kéo quá mạnh làm chồng chất hoặc nát tế bào: cần dàn nhẹ, đều tay và nên dàn luôn ngay khi rút kim.

+ Quá nghèo tế bào hoặc không lấy được tổn thương: Cần chọc đúng tổn thương, cố định tốt vùng chọc, hút bằng áp lực âm.

+ Dịch bị khô trong lòng kim hoặc trên phiến kính trước khi dàn: Nhanh chóng phết bệnh phẩm lên phiến kính và dàn ngay.

- Các trường hợp đánh giá chưa đạt có thể làm lại kĩ thuật ở một vị trí hoặc hướng khác.

6.4. Kết thúc thủ thuật

- Đánh giá tình trạng người bệnh sau thực hiện thủ thuật; dặn người bệnh không để vùng thực hiện thủ thuật dính nước trong 24 giờ.

- Ghi đầy đủ các thông tin về bệnh phẩm trên phiếu chỉ định: số lượng u, kích thước u, tính chất u trên siêu âm, thời gian lấy mẫu, số lượng mẫu,…

- Kiểm tra lại thông tin bệnh nhân trên lam kính và/hoặc trên lọ đựng bệnh phẩm và phiếu chỉ định.

- Đóng gói lam kính và/hoặc lọ đựng bệnh phẩm theo tiêu chuẩn vận chuyển bệnh phẩm, gửi đến phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh – tế bào ngay trong ngày.

7. THEO DÕI VÀ XỬ TRÍ TAI BIẾN

- Chảy máu tại vị trí chọc: băng ép cầm máu..

- Người bệnh choáng sau chọc: Để bệnh nhân nằm nghỉ và xử trí chống choáng.

- Nhiễm trùng tạo vị trí chọc: Chuyển bác sĩ lâm sàng khám và kê đơn chống viêm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Đề cương tài liệu chuyên môn hướng dẫn quy trình kỹ thuật khám bệnh chữa bệnh; Bộ y tế Quyết định 3023/QĐ-BYT; 2023.

2. Sigmon DF, Fatima S. Fine Needle Aspiration. (2022). StatPearls Publishing.

3. Dey, P. (2022). The Basic Technique of Fine Needle Aspiration Cytology. In: Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer, Singapore. https://doi.org/10.1007/978-981-19-6616-3_15.

2. CHỌC HÚT KIM NHỎ MỘT VỊ TRÍ TỔN THƯƠNG HOẶC U CỦA DA, DƯỚI DA VÀ CÁC CƠ QUAN CÓ VỊ TRÍ NÔNG DƯỚI HƯỚNG DẪN CỦA SIÊU ÂM

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả và hướng dẫn cách thực hiện lấy bệnh phẩm tế bào bằng kĩ thuật chọc hút kim nhỏ của các tổn thương hoặc các khối u da, dưới da hoặc các cơ quan ở vị trí nông (như tuyến vú, hạch, tuyến nước bọt, tuyến giáp,…); có hướng dẫn của các thiết bị chẩn đoán hình ảnh; nhằm lấy đúng vùng tổn thương, lấy được bệnh phẩm đủ và phù hợp cho xét nghiệm tế bào học cũng như các xét nghiệm khác (hoá tế bào, khối tế bào,…).

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Chọc hút tế bào bằng kim nhỏ (FNA- Fine Needle Aspiration) là kỹ thuật sử dụng kim tiêm, đưa kim qua da vào vùng tổn thương, hút tế bào theo phương pháp mao dẫn hoặc hút với áp lực âm (có gắn bơm tiêm) để các tế bào từ mô đi vào trong kim, bơm chất dịch lấy được trên lam kính và/hoặc vào dung dịch bảo quản phù hợp để phục vụ xét nghiệm chẩn đoán tế bào học cũng như các xét nghiệm khác.

Thực hiện lấy bệnh phẩm tế bào dưới hướng dẫn của siêu âm là kỹ thuật FNA kết hợp cùng siêu âm tại vị trí nghi ngờ nhằm xác định đúng tổn thương và hướng dẫn hướng đi của kim tiêm để nâng cao độ chính xác.

2. CHỈ ĐỊNH

- Tổn thương u có thể sờ thấy bằng khám lâm sàng hoặc không sờ thấy rõ trên khám lâm sàng.

3. CHỐNG CHỈ ĐỊNH

- Người bệnh có bệnh nặng toàn thân: suy tim, suy thận, suy hô hấp;

- Người bệnh có rối loạn đông máu;

4. THẬN TRỌNG

- Thận trọng với người bệnh có tiền sử động kinh, cao huyết áp,…

- Thận trọng với các tổn thương đang trong giai đoạn viêm, đặc biệt trong viêm cấp hoặc viêm nhiễm nặng tại chỗ.

- Người bệnh quá mức lo lắng, không hợp tác.

- Các trường hợp tổn thương khu trú tại gan, đặc biệt là những tổn thương nghi ngờ ung thư.

5. CHUẨN BỊ

5.1. Người thực hiện

- Nhân lực trực tiếp:

+ Bác sĩ được hướng dẫn hoặc đào tạo kỹ thuật: 01

+ Bác sĩ phụ: 01

+ Kỹ thuật y: 01

- Nhân lực hỗ trợ:

+ Nhân viên hành chính;

+ Hộ lý, nhân viên vệ sinh.

5.2. Thuốc, hoá chất

- Thuốc gây tê tại chỗ;

- Cồn 70 độ sát khuẩn hoặc dung dịch cồn iod. Có thể sử dụng bông có thấm sẵn cồn sát khuẩn (nếu có);

- Dung dịch cố định bệnh phẩm: cồn tuyệt đối,…

- Gel sử dụng trong siêu âm;

- Dung dịch sát khuẩn tay nhanh;

- Dung dịch rửa tay thường quy;

- Nước cất;

- Các thuốc trong hộp chống sốc.

5.3. Vật tư, dụng cụ

 Vật tư tiêu hao:

- Kim chọc hút chuyên dụng;

- Bơm tiêm 10ml hoặc 20ml;

- Lam kính sạch, một đầu mài mờ để ghi thông tin người bệnh;

- Lọ chứa dung dịch cố định để chứa bệnh phẩm;

- Bông khô tiệt trùng;

- Băng dính y tế;

- Găng tay sạch, khẩu trang, mũ y tế;

- Giấy/khăn lau tay;

- Giấy A4; sổ bàn giao bệnh phẩm.

- Bút dạ dầu, bút chì mềm, bút bi;

Dụng cụ:

- Dụng cụ gắn bơm tiêm;

- Pipet nhựa;

- Hộp inox đựng bông cồn, bông khô có nắp đậy;

- Ống inox đựng phanh, kéo;

- Panh thẳng không mấu

- Kéo inox;

- 2 Khay quả đậu đựng dụng cụ, vật tư sạch và vật tư đã sử dụng;

- Hộp đựng bông cồn sát trùng và hộp đựng bông khô tiệt trùng;

- Hộp bằng thép không rỉ đựng bơm, kim tiêm sạch;

- Hộp chống sốc;

- Khay/giá để tiêu bản;

- Hộp vận chuyển bệnh phẩm;

- Tấm phủ vô khuẩn;

- Túi rác thải y tế; túi rác thải thông thường;

- Hộp đựng rác thải sắc nhọn;

- Thùng đựng rác thải y tế (màu vàng) và thông thường (màu xanh).

5.4. Trang thiết bị

- Ống nghe, máy đo huyết áp;

- Máy siêu âm có đầu dò phù hợp;

- Giường làm thủ thuật.

- Xe tiêm 2 tầng đựng dụng cụ.

- Kính hiển vi quang học;

- Máy tính, máy in; máy quét mã vạch.

5.5. Chuẩn bị người bệnh

- Giải thích cho người bệnh hoặc người nhà người bệnh về quy trình thực hiện, mục đích, nguy cơ, lợi ích; để người bệnh yên tâm và hợp tác làm xét nghiệm.

- Khai thác tiền sử bệnh và các triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng.

5.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: Ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân, tên khoa phòng, chẩn đoán, thời gian lấy mẫu, kết quả khám lâm sàng và tiền sử của bệnh nhân.

5.7. Thời gian thực hiện kỹ thuật:

- Thời gian thực hiện kĩ thuật: 30 phút

5.8. Địa điểm thực hiện kỹ thuật:

- Phòng thủ thuật hoặc phòng xét nghiệm tế bào học.

5.9. Kiểm tra hồ sơ

- Kiểm tra người bệnh: Đánh giá tính chính xác của người bệnh: đúng người bệnh, đúng chẩn đoán, đúng vị trí thực hiện kỹ thuật.

- Thực hiện bảng kiểm an toàn thủ thuật;

6. TIẾN HÀNH QUY TRÌNH KỸ THUẬT

6.1. Siêu âm đánh giá lại tổn thương

- Giải thích cho bệnh nhân về thủ thuật.

- Người bệnh nằm theo đúng tư thế có thể bộc lộ rõ vùng tổn thương.

- Người bệnh quá kích thích, không nằm yên: cần cho thuốc an thần…

- Siêu âm đánh giá vị trí tổn thương, mật độ, tính chất,…

- Đánh dấu vị trí tại da.

- Sát trùng da sau đó phủ khăn phủ vô khuẩn có lỗ.

6.2. Lấy bệnh phẩm

- Chuẩn bị dụng cụ chọc, lam kính viết tên, tuổi, mã số của bệnh nhân.

- Đặt đầu dò tìm vị trí chọc kim thuận lợi nhất: tổn thương nằm giữa đường dẫn, đường đi không xuyên qua mạch máu, đường đi ngắn nhất.

- Sát khuẩn đầu dò, bôi đủ gel lên đầu dò, bọc đầu dò bằng găng vô khuẩn.

- Sát khuẩn lại vùng da vị trí chọc.

- Gây tê tại chỗ.

- Nhân viên phụ cầm đầu dò vị trí nghiêng, cố định tại vị trí có thể nhìn rõ u.

- Đưa kim tiêm chọc hút vào ổ tổn thương theo đúng đường đã định trước, quan sát trên màn hình siêu âm điều chỉnh đầu kim đúng tổn thương. Hút dưới áp lực âm để dịch chọc chui vào trong lòng kim. Rút nhanh kim qua da.

- Dùng áp lực của bơm tiêm, đưa toàn bộ bệnh phẩm ra khỏi bơm kim tiêm lên lam kính và/hoặc cho vào lọ chứa dung dịch cố định bệnh phẩm tế bào có sẵn.

- Nếu lấy bệnh phẩm lên lam kính cần dàn mỏng ngay, lực dàn vừa phải. Có thể dùng kim dàn bệnh phẩm hoặc dùng 2 lam kính dàn đều bệnh phẩm.

- Có thể hút nhiều vị trí tổn thương nếu u > 1,5cm.

- Sát trùng lại và băng vị trí chọc để tránh chảy máu.

6.3. Đánh giá bệnh phẩm về đại thể

- Yêu cầu kết quả của lam kính chứa bệnh phẩm: Dàn đều, mỏng, ít máu.

- Lam kính bệnh phẩm không đạt:

+ Quá nhiều hồng cầu: không đổi hướng mũi kim khi kim đã đâm vào mô để tránh chảy máu khi chọc hoặc thấy nhiều máu có thể chọc thêm 1 vị trí khác nếu u đủ lớn.

+ Lam kính bệnh phẩm dàn quá dày hoặc kéo quá mạnh làm chồng chất hoặc nát tế bào: cần dàn nhẹ, đều tay và nên dàn luôn ngay khi rút kim.

+ Quá nghèo tế bào hoặc không lấy được tổn thương: Cần chọc đúng tổn thương, cố định tốt vùng chọc, hút bằng áp lực âm.

+ Dịch bị khô trong lòng kim hoặc trên phiến kính trước khi dàn: Nhanh chóng phết bệnh phẩm lên phiến kính và dàn ngay.

- Các trường hợp đánh giá chưa đạt có thể làm lại kĩ thuật ở một vị trí hoặc hướng khác.

6.4. Kết thúc kỹ thuật

- Đánh giá tình trạng người bệnh sau thực hiện thủ thuật; dặn người bệnh nằm tại giường nếu cần.

- Ghi đầy đủ các thông tin về bệnh phẩm trên phiếu chỉ định: số lượng u, kích thước u, tính chất u trên siêu âm, thời gian lấy mẫu, số lượng mẫu,…

- Kiểm tra lại thông tin bệnh nhân trên lam kính và/hoặc trên lọ đựng bệnh phẩm. Nắp lọ kín tránh tràn đổ.

- Để khô lam kính tự nhiên trong khoảng 10 phút. Có thể sử dụng tủ ấm hoặc máy sấy để làm khô bệnh phẩm nếu không khí có độ ẩm cao.

- Cố định lam kính bệnh phẩm bằng dung dịch cố định. Nên cố định ngay sau khô, nếu cố định kém tế bào thoái hoá và không đánh giá đúng tổn thương.

- Đóng gói lam kính và/hoặc lọ đựng bệnh phẩm theo tiêu chuẩn vận chuyển bệnh phẩm, gửi đến phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh – tế bào ngay trong ngày.

7. THEO DÕI VÀ XỬ TRÍ TAI BIẾN

- Chảy máu tại vị trí chọc hoặc trong ổ bụng: chuyển ngoại khoa xử trí.

- Rỉ mật, dịch tiêu hoá vào ổ bụng: chuyển ngoại khoa để phẫu thuật.

- Tràn khí màng phổi: chuyển cấp cứu xử trí.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Đề cương tài liệu chuyên môn hướng dẫn quy trình kỹ thuật khám bệnh chữa bệnh; Bộ y tế Quyết định 3023/QĐ-BYT; 2023.

2. Sigmon DF, Fatima S. Fine Needle Aspiration. (2022). StatPearls Publishing.

3. Dey, P. (2022). The Basic Technique of Fine Needle Aspiration Cytology. In: Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer, Singapore. https://doi.org/10.1007/978-981-19-6616-3_15.

3. CHỌC HÚT KIM NHỎ CÁC TỔN THƯƠNG HOẶC U Ở VỊ TRÍ SÂU (Ổ BỤNG, TRUNG THẤT,…) DƯỚI HƯỚNG DẪN CỦA SIÊU ÂM

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả và hướng dẫn cách thực hiện lấy bệnh phẩm tế bào các bộ phận ở vị trí sâu (gan, lách, hạch trung thất, tuỵ, hạch ổ bụng,…) dưới hướng dẫn của siêu âm; để lấy đúng vùng tổn thương, lấy được bệnh phẩm đủ và phù hợp cho xét nghiệm tế bào học cũng như các xét nghiệm khác.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Chọc hút tế bào bằng kim nhỏ (FNA- Fine Needle Aspiration) là kỹ thuật sử dụng kim tiêm, đưa kim qua da vào vùng tổn thương, hút tế bào theo phương pháp mao dẫn hoặc hút với áp lực âm (có gắn bơm tiêm) để các tế bào từ mô đi vào trong kim, bơm chất dịch lấy được trên lam kính và/hoặc vào dung dịch bảo quản phù hợp.

Các mô nằm sâu không thể kiểm tra thấy trên lâm sàng, dễ chảy máu, vì vậy cần quan sát trên siêu âm để xác định chính xác vị trí tổn thương, hướng dẫn hướng đi của kim tiêm nhằm lấy chính xác tổn thương. Bệnh phẩm của chọc tế bào có thể sử dụng để chẩn đoán tế bào học và các xét nghiệm khác.

2. CHỈ ĐỊNH

- Các trường hợp tổn thương khu trú tại các vị trí sâu, đặc biệt là những tổn thương nghi ngờ ác tính.

3. CHỐNG CHỈ ĐỊNH

- Người bệnh có bệnh nặng toàn thân: suy tim, suy thận, suy hô hấp;

- Người bệnh có rối loạn đông máu.

4. THẬN TRỌNG

- Thận trọng với người bệnh có tiền sử động kinh, cao huyết áp, cổ trướng,…

- Người bệnh quá mức lo lắng, không hợp tác.

5. CHUẨN BỊ

5.1. Người thực hiện

- Nhân lực trực tiếp:

+ Bác sĩ được hướng dẫn hoặc đào tạo kỹ thuật: 01

+ Bác sĩ phụ: 01

+ Kỹ thuật y: 01

+ Điều dưỡng: 01

- Nhân lực hỗ trợ:

+ Nhân viên hành chính;

+ Hộ lý, nhân viên vệ sinh.

5.2. Thuốc, hoá chất

- Thuốc gây tê tại chỗ;

- Cồn 70 độ sát khuẩn hoặc dung dịch cồn iod. Có thể sử dụng bông có thấm sẵn cồn sát khuẩn (nếu có);

- Dung dịch cố định bệnh phẩm: cồn tuyệt đối,…

- Gel sử dụng trong siêu âm;

- Dung dịch sát khuẩn tay nhanh;

- Dung dịch rửa tay thường quy;

- Nước cất;

- Các thuốc trong hộp chống sốc.

5.3. Vật tư, dụng cụ

 Vật tư tiêu hao:

- Kim chọc hút chuyên dụng;

- Bơm tiêm 10ml hoặc 20ml;

- Lam kính sạch, một đầu mài mờ để ghi thông tin người bệnh;

- Lọ chứa dung dịch cố định để chứa bệnh phẩm;

- Bông khô tiệt trùng;

- Băng dính y tế;

- Găng tay sạch, khẩu trang, mũ y tế;

- Giấy/khăn lau tay;

- Giấy A4; sổ bàn giao bệnh phẩm.

- Bút dạ dầu, bút chì mềm, bút bi;

Dụng cụ:

- Dụng cụ gắn bơm tiêm;

- Pipet nhựa;

- Hộp inox đựng bông cồn, bông khô có nắp đậy;

- Ống inox đựng phanh, kéo;

- Panh thẳng không mấu

- Kéo inox;

- 2 Khay quả đậu đựng dụng cụ, vật tư sạch và vật tư đã sử dụng;

- Hộp đựng bông cồn sát trùng và hộp đựng bông khô tiệt trùng;

- Hộp bằng thép không rỉ đựng bơm, kim tiêm sạch;

- Hộp chống sốc;

- Khay/giá để tiêu bản;

- Hộp vận chuyển bệnh phẩm.

- Tấm phủ vô khuẩn;

- Túi rác thải y tế; túi rác thải thông thường;

- Hộp đựng rác thải sắc nhọn;

- Thùng đựng rác thải y tế (màu vàng) và thông thường (màu xanh).

5.4. Trang thiết bị

- Ống nghe, máy đo huyết áp;

- Máy siêu âm có đầu dò phù hợp;

- Giường làm thủ thuật.

- Xe tiêm 2 tầng đựng dụng cụ.

- Kính hiển vi quang học;

- Máy tính, máy in; máy quét mã vạch.

5.5. Chuẩn bị người bệnh

- Giải thích cho người bệnh hoặc người nhà người bệnh về quy trình thực hiện, mục đích, nguy cơ, lợi ích; để người bệnh yên tâm và hợp tác làm xét nghiệm.

- Khai thác tiền sử bệnh và các triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng.

5.6. Hồ sơ bệnh án

- Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: Ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân, tên khoa phòng, chẩn đoán, thời gian lấy mẫu, kết quả khám lâm sàng và tiền sử của bệnh nhân.

- Phim cắt lớp vi tính, cộng hưởng từ nếu có.

5.7. Thời gian thực hiện kỹ thuật:

- Thời gian thực hiện kĩ thuật: 30 phút

5.8. Địa điểm thực hiện kỹ thuật:

- Phòng thủ thuật hoặc phòng xét nghiệm tế bào học.

5.9. Kiểm tra hồ sơ

- Kiểm tra người bệnh: Đánh giá tính chính xác của người bệnh: đúng người bệnh, đúng chẩn đoán, đúng vị trí thực hiện kỹ thuật.

- Thực hiện bảng kiểm an toàn thủ thuật;

6. TIẾN HÀNH QUY TRÌNH KỸ THUẬT

6.1. Siêu âm đánh giá lại tổn thương và chọn đường vào

- Tại phòng can thiệp: người bệnh nằm, đặt đường truyền tĩnh mạch, lắp máy theo dõi nhịp thở, mạch, huyết áp, điện tâm đồ, SpO2.

- Người bệnh quá kích thích, không nằm yên: cần cho thuốc an thần…

- Siêu âm đánh giá vị trí tổn thương, mật độ, tính chất,…

- Đánh dấu vị trí tại da.

- Sát khuẩn rộng vùng da bằng dung dịch sát khuẩn tiêu chuẩn và phủ sand lỗ.

- Chuẩn bị dụng cụ chọc, lam kính viết tên, tuổi, mã số của bệnh nhân.

- Tìm vị trí chọc kim thuận lợi nhất: tổn thương nằm giữa đường dẫn, đường đi không xuyên qua mạch máu hoặc ống tiêu hoá, đường đi ngắn nhất.

- Mỗi cơ quan khuyến cáo vị trí khác nhau: Với lách, thường sử dụng ở khoảng gian sườn 10 đến 12 trên đường nách giữa để tránh chọc vào màng phổi.

- Sát khuẩn đầu dò, bôi đủ gel lên đầu dò, bọc đầu dò bằng găng vô khuẩn.

- Sát khuẩn lại vùng da vị trí chọc.

- Gây tê tại chỗ: Gây tê theo hướng vào khối u từ da đến phúc mạc, gây tê dưới bao lách. Chờ 1 phút cho thuốc tê có hiệu lực.

- Nhân viên phụ cầm đầu dò vị trí nghiêng, cố định tại vị trí có thể nhìn rõ u.

- Đưa kim tiêm chọc hút vào ổ tổn thương theo đúng đường đã định trước, quan sát trên màn hình siêu âm điều chỉnh đầu kim đúng tổn thương. Hút dưới áp lực âm để dịch chọc chui vào trong lòng kim. Rút nhanh kim qua da.

- Dùng áp lực của bơm tiêm, đưa toàn bộ bệnh phẩm ra khỏi bơm kim tiêm lên lam kính và/hoặc cho vào lọ chứa dung dịch cố định bệnh phẩm tế bào có sẵn.

- Nếu lấy bệnh phẩm lên lam kính cần dàn mỏng ngay, lực dàn vừa phải. Có thể dùng kim dàn bệnh phẩm hoặc dùng 2 lam kính dàn đều bệnh phẩm.

- Lấy thêm bệnh phẩm làm xét nghiệm tế bào theo quy trình sinh thiết bệnh phẩm làm xét nghiệm giải phẫu bệnh.

- Sát trùng lại và băng vị trí chọc để tránh chảy máu.

6.3. Đánh giá bệnh phẩm về đại thể

- Yêu cầu kết quả của lam kính chứa bệnh phẩm: Dàn đều, mỏng, ít máu.

- Lam kính bệnh phẩm không đạt:

+ Quá nhiều hồng cầu: không đổi hướng mũi kim khi kim đã đâm vào mô để tránh chảy máu khi chọc hoặc thấy nhiều máu có thể chọc thêm 1 vị trí khác nếu u đủ lớn.

+ Lam kính bệnh phẩm dàn quá dày hoặc kéo quá mạnh làm chồng chất hoặc nát tế bào: cần dàn nhẹ, đều tay và nên dàn luôn ngay khi rút kim.

+ Quá nghèo tế bào hoặc không lấy được tổn thương: Cần chọc đúng tổn thương, cố định tốt vùng chọc, hút bằng áp lực âm.

+ Dịch bị khô trong lòng kim hoặc trên phiến kính trước khi dàn: Nhanh chóng phết bệnh phẩm lên phiến kính và dàn ngay.

- Các trường hợp đánh giá chưa đạt có thể làm lại kĩ thuật ở một vị trí hoặc hướng khác.

6.4. Kết thúc kỹ thuật

- Đánh giá tình trạng người bệnh sau thực hiện thủ thuật; dặn người bệnh nằm tại giường trong 6 giờ, theo dõi mạch, huyết áp và thành bụng trong 24 giờ.

- Ghi đầy đủ các thông tin về bệnh phẩm trên phiếu chỉ định: số lượng u, kích thước u, tính chất u trên siêu âm, thời gian lấy mẫu, số lượng mẫu,…

- Kiểm tra lại thông tin bệnh nhân trên lam kính và/hoặc trên lọ đựng bệnh phẩm. Nắp lọ kín tránh tràn đổ.

- Để khô lam kính tự nhiên trong khoảng 10 phút. Có thể sử dụng tủ ấm hoặc máy sấy để làm khô bệnh phẩm nếu không khí có độ ẩm cao.

- Cố định lam kính bệnh phẩm bằng dung dịch cố định. Nên cố định ngay sau khô, nếu cố định kém tế bào thoái hoá và không đánh giá đúng tổn thương.

- Đóng gói lam kính và/hoặc lọ đựng bệnh phẩm theo tiêu chuẩn vận chuyển bệnh phẩm, gửi đến phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh – tế bào ngay trong ngày.

7. THEO DÕI VÀ XỬ TRÍ TAI BIẾN

- Chảy máu tại vị trí chọc hoặc trong ổ bụng: chuyển ngoại khoa xử trí.

- Tràn khí màng phổi: chuyển cấp cứu xử trí.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Đề cương tài liệu chuyên môn hướng dẫn quy trình kỹ thuật khám bệnh chữa bệnh; Bộ y tế Quyết định 3023/QĐ-BYT; 2023.

2. Sigmon DF, Fatima S. Fine Needle Aspiration. (2022). StatPearls Publishing.

3. Dey, P. (2022). The Basic Technique of Fine Needle Aspiration Cytology. In: Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer, Singapore. https://doi.org/10.1007/978-981-19-6616-3_15.

4. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ BÀO HỌC CÁC BỆNH PHẨM CHỌC HÚT KIM NHỎ, ÁP LAM

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện nhuộm và chẩn đoán tế bào học trên bệnh phẩm tế bào chọc hút kim nhỏ hoặc áp lam.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Bệnh phẩm tế bào của quá trình chọc tế bào hoặc bệnh phẩm tế bào bong, tế bào lấy từ cạo hoặc áp lam tổn thương được dàn trên lam kính, sau đó được nhuộm bằng các phương pháp đặc biệt để đánh giá hình thái tế bào và chẩn đoán tế bào học.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư, hóa chất

- Găng tay vô trùng, khẩu trang.

- Pipet nhựa.

- Lam kính.

- Giá đựng lam kính.

- Bút chì mềm ghi mã số người bệnh, vị trí chọc hút.

- Các dụng cụ để nhuộm: khay, cốc pha thuốc nhuộm, ống hút.

- Phiếu xét nghiệm ghi rõ họ và tên người bệnh, vị trí lấy dịch, số lượng dịch, màu sắc, thời gian lấy, người thực hiện kỹ thuật, số lượng phiến đồ.

- Dung dịch cố định phù hợp.

- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm phiến đồ (Giemsa/Diff - Quick/ Hematoxylin Eosin/ Papanicolaou/ Ziehl - Neelsen…).

- Các dung dịch sát khuẩn.

- Nước cất, nước sạch để rửa thuốc nhuộm trên lam kính.

2.3. Trang thiết bị

- Bàn sấy tiêu bản.

- Kính hiển vi quang học (nên có gắn camera chụp ảnh vi thể);

- Máy tính, máy in; đầu quét mã vạch;

- Tủ lưu tiêu bản; tủ lưu hồ sơ;

- Thùng rác đựng rác thải y tế và rác thải thường.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Lấy bệnh phẩm: Việc lấy mẫu được thực hiện theo Quy trình chọc hút kim nhỏ (FNA) (có thể có hoặc không dưới hướng dẫn của siêu âm).

Yêu cầu: bệnh phẩm hút ra được dàn lên lam kính, để khô tự nhiên, sau đó cố định phiến đồ theo đúng hướng dẫn.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 30 phút

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm đủ tiêu chuẩn.

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn Phòng xét nghiệm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

Bước 1: Cố định phiến đồ:

- Cố định bằng dung dịch phù hợp lên toàn bộ bề mặt lam kính có chứa bệnh phẩm trước khi nhuộm (dung dịch cố định tuỳ phương pháp nhuộm).

Bước 2: Nhuộm các phiến đồ

- Theo một trong các phương pháp nhuộm: Giemsa, Papanicolaou, Diff - Quick hay May Grünwanld Giemsa, Ziehl – Neelsen hoặc Hematoxylin Eosin (tham khảo các phương pháp nhuộm tại Phần III).

4.2. Nhận định kết quả

Phiến đồ sau khi nhuộm màu xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi

Bác sĩ Giải phẫu bệnh Tế bào, từ đó đưa ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh:

+ Đánh giá loại tế bào, hình thái, cấu trúc, đánh giá nền, mô đệm

+ Phân loại tổn thương: viêm, tổn thương u lành, u ác tính, phân típ,...

+ Chẩn đoán tế bào theo các hệ thống phân loại được khuyến cáo (hệ thống phân loại Bethesda, ....)

+ Phiên giải kết quả cần kết hợp với các thông tin lâm sàng, cận lâm sàng bác sĩ lâm sàng cung cấp hoặc xem bệnh án. Các kết quả có giá trị cảnh báo (Ví dụ: nghi ngờ ác tính) cần được ghi vào phiếu kết quả xét nghiệm hoặc báo cho bác sĩ khám, điều trị.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định cơ sở.

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

- Phiến đồ bị mất tế bào trong quá trình cố định: cần để khô sau khi dàn 10-30 phút trước khi cố định bằng cồn.

- Bong bệnh phẩm: rửa nhẹ nhàng, nên dùng lam kính có phủ chất chống bong

- Các tế bào dày, chồng chất: lấy lượng dịch vừa đủ, dàn đều tay

- Tế bào thoái hóa, tan rã, không nhận định được hình thái nhân và bào tương: dịch lấy ra khỏi cơ thể phải làm xét nghiệm ngay.

- Các tế bào bắt màu quá kém: cần cố định tốt và nhuộm đủ thời gian, thuốc nhuộm tốt.

- Nhuộm quá đậm: tẩy bớt thuốc nhuộm bằng cồn tuyệt đối.

- Các tế bào bị kéo dài hoặc bị dập nát: cần thực hiện đúng kỹ thuật.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

2. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

5. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ BÀO HỌC DỊCH CƠ THỂ

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện xét nghiệm và chẩn đoán tế bào học các loại mẫu dịch lấy từ cơ thể.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Trong các loại dịch của cơ thể như dịch phế quản, dịch màng phổi, dịch khớp, dịch ổ bụng, nước tiểu… có thể có các tế bào bong ra, tế bào u từ các tổn thương ở đó. Vì vậy, cần lấy được các tế bào này và nhận định loại tế bào, hình thái, số lượng tế bào trong dịch, sự sắp xếp tế bào, nền phiến đồ dưới kính hiển vi quang học để chẩn đoán bệnh.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư, hóa chất

- Găng tay vô trùng, khẩu trang.

- Ống hút tự động.

- Pipet nhựa

- Lọ đựng dịch ly tâm

- Lam kính sạch, một đầu mài mờ.

- Giá để đựng lam kính đã dàn bệnh phẩm.

- Bút chì mềm ghi mã số người bệnh, vị trí chọc hút.

- Các dụng cụ để nhuộm: khay, giá, cốc pha thuốc nhuộm, ống hút.

- Phiếu xét nghiệm ghi rõ họ và tên người bệnh, vị trí lấy dịch, số lượng dịch, màu sắc, thời gian lấy, người thực hiện kỹ thuật, số lượng phiến đồ.

- Dung dịch cố định phù hợp

- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm phiến đồ (Giemsa/Diff - Quick/ Hematoxylin Eosin/ Papanicolaou/ Ziehl - Neelsen…).

- Các dung dịch sát khuẩn.

2.3. Trang thiết bị

- Máy ly tâm;

- Bàn sấy tiêu bản;

- Kính hiển vi quang học;

- Máy tính, máy in; đầu quét mã vạch;

- Tủ lưu tiêu bản; tủ lưu hồ sơ;

- Thùng rác đựng rác thải y tế và rác thải thường.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Lấy bệnh phẩm: Việc lấy mẫu được thực hiện bởi các khoa lâm sàng và gửi bệnh phẩm về Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh.

Yêu cầu: dịch hút ra phải cho vào các lọ đựng bệnh phẩm sạch không có chất bảo quản, có đầy đủ thông tin về bệnh nhân trên nhãn dán.

Bệnh phẩm được vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh hoặc bảo quản trong nhiệt độ 2-8°C nếu chưa vận chuyển ngay.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 1 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn Phòng xét nghiệm

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

Bước 1: Tập trung tế bào

- Ly tâm dịch bằng máy ly tâm.

- Gạn bỏ phần trong bên trên, lấy phần lắng cặn tế bào bên dưới (1-2ml)

Bước 2: Làm phiến đồ:

- Dùng pipet hút dịch cặn dàn đều lên các lam kính đã ghi sẵn mã người bệnh.

- Dùng một lam kính sạch khác đặt lên trên cặn, dàn nhẹ, đều bệnh phẩm giữa hai lam kính để bệnh phẩm được dàn mỏng, đều

Bước 3: Cố định phiến đồ:

- Cố định bằng dung dịch phù hợp lên toàn bộ bề mặt lam kính có chứa bệnh phẩm trước khi nhuộm (dung dịch cố định tuỳ phương pháp nhuộm).

Bước 4 Nhuộm các phiến đồ

- Theo một trong các phương pháp nhuộm: Giemsa, Papanicolaou, Diff - Quick hay May Grünwanld Giemsa, Ziehl – Neelsen hoặc Hematoxylin Eosin như đã nêu ở mục nhuộm phiến đồ tế bào học.

- Lưu ý: Đối với các bệnh phẩm đã được các khoa lâm sàng chọc hút và áp nhuộm phết lam kính rồi thì cần được gửi ngay lên Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh để thực hiện xét nghiệm, và tiến hành quy trình xét nghiệm từ bước cố định phiến đồ.

4.2. Nhận định kết quả

Phiến đồ sau khi nhuộm màu xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh:

+ Đánh giá loại tế bào, hình thái, cấu trúc, đánh giá nền, mô đệm

+ Phân loại tổn thương: viêm, tổn thương u lành, u ác tính, phân típ,...

+ Chẩn đoán tế bào theo các hệ thống phân loại được khuyến cáo (hệ thống phân loại Bethesda, ....)

+ Phiên giải kết quả cần kết hợp với các thông tin lâm sàng, cận lâm sàng bác sĩ lâm sàng cung cấp hoặc xem bệnh án. Các kết quả có giá trị cảnh báo (Ví dụ: nghi ngờ ác tính) cần được ghi vào phiếu kết quả xét nghiệm hoặc báo cho bác sĩ khám, điều trị.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

- Phiến đồ bị mất tế bào trong quá trình cố định: cần để khô sau khi dàn 10-30 phút trước khi cố định bằng cồn tuyệt đối.

- Bong bệnh phẩm: rửa nhẹ nhàng, nên dùng lam kính có phủ chất chống bong

- Các tế bào dày, chồng chất: lấy lượng dịch vừa đủ, dàn đều tay

- Tế bào thoái hóa, tan rã, không nhận định được hình thái nhân và bào tương: dịch lấy ra khỏi cơ thể phải làm xét nghiệm ngay.

- Các tế bào bắt màu quá kém: cần cố định tốt và nhuộm đủ thời gian.

- Nhuộm quá đậm: tẩy bớt thuốc nhuộm bằng cồn tuyệt đối.

- Các tế bào bị kéo dài hoặc bị dập nát: cần thực hiện đúng kỹ thuật.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

2. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

3. Freida Carson: Histotechnoloy, 3rd editon, 2017

6. XÉT NGHIỆM TẾ BÀO HỌC KẾT MẠC, GIÁC MẠC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ÁP (Impression Cytology – IC)

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Xét nghiệm tế bào học kết mạc, giác mạc bằng phương pháp áp (test áp) nhằm đánh giá hình thái của một vài lớp tế bào bề mặt của kết mạc/giác mạc; được chỉ định để chẩn đoán một số bệnh ở bề mặt nhãn cầu như: hội chứng khô mắt, viêm kết mạc vùng rìa, thiếu tế bào nguồn vùng rìa, tổn thương hắc tố ở kết mạc, u biểu mô kết giác mạc,...

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Kỹ thuật test áp dùng giấy lọc cellulose acetate đặt lên bề mặt nhãn cầu để lấy khoảng 2-3 lớp tế bào bề mặt của biểu mô kết – giác mạc; nếu muốn lấy được các lớp tế bào sâu hơn thì áp lại tại cùng một vị trí tổn thương.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ

- Kỹ thuật Y, Điều dưỡng

2.2. Vật tư, hoá chất

- Bông hấp tiệt trùng;

- Panh giác mạc và thìa nạo (Curette) đã hấp tiệt trùng;

- Giấy lọc cellulose acetate kích thước lỗ từ 0,22 µm - 0,44µm;

- Lam kính sạch một đầu mài mờ, bút viết kính, giá cắm lam;

- Đèn cồn;

- Pipet nhựa;

- Găng tay sạch, mũ, khẩu trang;

- Hộp đựng bông cắt nhỏ vô trùng, hộp đựng dụng cụ lấy bệnh phẩm bằng inox;

- Các dung dịch sát khuẩn;

- Hộp đựng dụng cụ sắc nhọn;

- Cốc pha thuốc nhuộm;

- Thuốc nhỏ mắt gây tê bề mặt nhãn cầu (Alcaine/dicain,...);

- Nước muối sinh lý 0,9% vô trùng/dung dịch thuốc nhỏ mắt sát khuẩn.;

- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm phiến đồ (Hematoxylin Eosin/Giemsa/Diff - Quick/ Papanicolaou/Ziehl – Neelsen,…);

- Dung dịch cố định phù hợp (Ví dụ: cồn etylic, axit axetic, formol,…);

- Dầu soi kính: điều kiện bảo quản nhiệt độ phòng.

2.3. Trang thiết bị

- Giường lấy bệnh phẩm, đèn soi;

- Bàn để dụng cụ, ghế ngồi cho Bác sĩ và kỹ thuật viên;

- Bàn có mặt phẳng rộng để đặt kính hiển vi;

- Tủ bảo quản hoá chất sinh phẩm;

- Tủ ấm 56°C;

- Kính hiển vi quang học;

- Sổ ghi kết quả, hộp thuốc chống sốc, ống nghe, máy đo huyết áp;

- Máy tính, máy in; đầu quét mã vạch;

- Tủ lưu tiêu bản; tủ lưu hồ sơ;

- Thùng đựng rác thải y tế, thùng đựng rác thải thông thường.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Chuẩn bị người bệnh:

+ Người bệnh được giải thích về quy trình thực hiện, mục đích, nguy cơ, lợi ích để người bệnh yên tâm và hợp tác làm xét nghiệm.

+ Khai thác tiền sử người bệnh có yếu tố dị ứng.

+ Hướng dẫn người bệnh phối hợp để lấy mẫu theo đúng yêu cầu.

+ Người bệnh ở tư thế thoải mái, phù hợp với cách lấy bệnh phẩm.

- Loại mẫu bệnh phẩm: Các tế bào bong ở một vài lớp tế bào bề mặt của biểu mô kết mạc và/hoặc giác mạc.

- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu, bảo quản: Panh giác mạc và thìa nạo (Curette), Giấy lọc cellulose acetate kích thước lỗ từ 0,22 µm - 0,44µm, lam, kính.

- Điều kiện bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm: Bảo quản, vận chuyển mẫu ở nhiệt độ phòng.

- Tiêu chuẩn mẫu bệnh phẩm: có các tế bào của các lớp bề mặt nhãn cầu tại vùng lấy mẫu dính vào Giấy lọc cellulose acetate.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm có đầy đủ các mục: họ tên, tuổi, số gường (đối với người bệnh đang điều trị nội trú), khoa, chẩn đoán, vị trí lấy bệnh phẩm, số lượng,...

- Kiểm tra người bệnh: Đúng người bệnh, đúng chỉ định, đúng mắt cần làm xét nghiệm

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 45 – 60 phút

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật.

Khoa Xét nghiệm hoặc Khoa Giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học (bước lấy bệnh phẩm có thể lấy ở khoa lâm sàng).

3. AN TOÀN

- Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo quy trình về an toàn xét nghiệm.

- Tất cả các mẫu bệnh phẩm được xem như là nguồn nhiễm

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

4.1.1. Tra thuốc gây tê bề mặt 1-2 lần, mỗi lần 1-2 giọt cách nhau khoảng 2 phút vào kết mạc cùng đồ dưới của mắt cần lấy bệnh phẩm.

4.1.2. Đặt vành mi hoặc dùng ngón tay cái và ngón tay trỏ vành mắt của người bệnh.

4.1.3. Thấm nhẹ phần thuốc gây tê và nước mắt còn thừa.

4.1.4. Dùng mảnh giấy lọc Cellulose acetate đã cắt sẵn theo kích thước phù hợp đặt lên bề mặt vùng tổn thương ở kết mạc hoặc giác mạc và dùng đầu của curette ấn nhẹ lên mảnh giấy, giữ như vậy trong khoảng từ 5-10 giây.

4.1.5. Dùng panh giác mạc nhẹ nhàng nhấc mảnh giấy ra khỏi bề mặt kết - giác mạc.

4.1.6. Cố định bệnh phẩm trong dung dịch cố định (cồn etylic 95° hoặc hỗn hợp axit axetic, formol 37% và cồn etylic theo tỷ lệ 1:1:20,..).

4.1.7. Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp Hematoxylin-Eosin hoặc Giemsa hoặc PAS hoặc Papanicolaou,… (đôi khi phải phối hợp nhuộm nhiều phương pháp).

4.2. Nhận định kết quả

- Nhận định kết quả trên kính hiển vi quang học

+ Các phiến đồ giàu tế bào, đều, các tế bào không chồng chất lên nhau.

+ Hình thái các tế bào được bảo tồn tốt.

+ Các tế bào bắt màu rõ ràng, phân biệt được rõ hình thái của nhân, bào tương hoặc các thành phần khác tùy vào phương pháp nhuộm.

- Kết luận sau khi phân tích hình thái tế bào, loại tế bào; đôi khi còn có thể đánh giá cả cấu trúc mô.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

- Trả kết quả chính xác, ghi chép rõ ràng kết quả và các thông tin theo quy định vào phiếu trả lời kết quả và sổ kết quả xét nghiệm.

- Lưu kết quả theo quy định của Bộ Y tế.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

- Người bệnh không hợp tác: thuyết phục, giải thích.

5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật:

- Người bệnh bị đau, chảy nhiều nước mắt, mắt không cố định nên khó thực hiện kỹ thuật: do lượng thuốc tê chưa đủ hoặc thời gian tra thuốc cho người bệnh đến khi thực hiện kỹ thuật nhanh, tra thêm thuốc tê hoặc tra thuốc tê theo đúng thời gian quy định.

- Người bệnh không hợp tác: thuyết phục, giải thích.

5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật

- Quá ít tế bào hoặc không lấy được tế bào: do vị trí đặt giấy áp ướt, có nhiều nước mắt và/hoặc thời gian đặt giấy áp nhanh quá.

- Cố định kém làm tế bào thoái hóa không nhận định được hình thái nhân và bào tương: giải thích cho người bệnh lấy bệnh phẩm làm lại xét nghiệm, cố định ngay sau khi dàn tiêu bản.

- Cặn thuốc nhuộm còn trên phiến đồ: cần lọc thuốc nhuộm trước khi dùng, rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy.

- Các tế bào bắt màu quá kém: do thuốc nhuộm pha chưa đúng tỷ lệ hoặc không nhuộm đủ thời gian. Kiểm tra lại thuốc nhuộm, nhuộm đủ thời gian.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh, Tế bào học (Ban hành kèm theo Quyết định số 5199/QĐ-BYT ngày 25 tháng 12 năm 2013 của Bộ trưởng Bộ Y tế).

2. Đề cương quy trình kỹ thuật xét nghiệm (Ban hành kèm theo Quyết định số 3376/QĐ-BYT ngày 30 tháng 8 năm 2023 của Bộ trưởng Bộ Y tế).

3. Diagnostic technologies in Ophthalmology. Bentham Books, 2012.

7. XÉT NGHIỆM TẾ BÀO HỌC KẾT MẠC, GIÁC MẠC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NẠO (Scraping cytology on the conjunctive and cornea)

1. ĐẠI CƯƠNG

Xét nghiệm Tế bào học chất nạo kết mạc, giác mạc là một phần quan trọng trong chẩn đoán và điều trị các bệnh lý viêm loét giác mạc, viêm kết mạc,... giúp xác định được nguyên nhân, đặc biệt trong các trường hợp nghi ngờ tác nhân là virus, dị ứng.

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện xét nghiệm và chẩn đoán tế bào học mẫu bệnh phẩm chất nạo kết mạc, giác mạc.

Xét nghiệm tế bào học trong các bệnh ở kết mạc, giác mạc (viêm kết mạc, viêm giác mạc, loét giác mạc..) bằng phương pháp nạo là xác định về sự có mặt, tỉ lệ và phân tích sự biến đổi hình thái của các tế bào, có trong bệnh phẩm nhằm hỗ trợ công tác chẩn đoán, theo dõi và điều trị bệnh.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Tế bào trong các chất nạo kết mạc, giác mạc được phết lên lam kính tạo thành một lớp mỏng, cố định ngay bằng cồn 90-99°C (cố định ướt) hoặc để khô trong không khí (cố định khô) và nhuộm bằng phương pháp Giemsa.

Nguyên lý của nhuộm Giemsa là dựa trên nhóm phophat của phẩm nhuộm gắn với liên kết adenin - thymin, liên kết có nhiều ở DNA trong tế bào. Phản ứng oxy hóa sẽ tạo ra màu xanh của metylen ở nhân tế bào, bào tương tế bào có thể bắt màu xanh hoặc hồng. Quan sát tiêu bản nhuộm bằng kính hiển vi quang học để nhận định sự thay đổi về số lượng, hình dạng, kích thước, nhân và nguyên sinh chất, phát hện ra các Chlamydia, thể vùi virus, tế bào bạch cầu toan, vi khuẩn....

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ

- Kỹ thuật Y, Điều dưỡng

2.2. Vật tư, hoá chất

- Bông hấp tiệt trùng;

- Dao mổ số 15 (dùng một lần)/thìa nạo (Curette)/kimura spatula vô trùng hoặc đã được hấp tiết trùng;

- Lam kính sạch một đầu mài mờ, bút viết kính, giá cắm lam;

- Đèn cồn;

- Pipet nhựa;

- Găng tay sạch, mũ, khẩu trang;

- Hộp đựng bông cắt nhỏ vô trùng, hộp đựng dụng cụ lấy bệnh phẩm bằng inox;

- Các dung dịch sát khuẩn;

- Hộp đựng dụng cụ sắc nhọn;

- Cốc pha thuốc nhuộm;

- Thuốc nhỏ mắt gây têbề mặt nhãn cầu (Alcaine hoặc thuốc tương đương);

- Nước muối sinh lý 0,9% vô trùng;

- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm phiến đồ (Giemsa/Diff - Quick/Hematoxylin Eosin/Papanicolaou/Ziehl – Neelsen,…);

- Dung dịch cố định phù hợp(Cồn cố định 90-99°C,...);

- Dầu soi kính: điều kiện bảo quản nhiệt độ phòng.

2.3. Trang thiết bị

- Giường lấy bệnh phẩm, đèn soi;

- Bàn để dụng cụ, ghế ngồi cho Bác sĩ và kỹ thuật viên;

- Bàn có mặt phẳng rộng để đặt kính hiển vi;

- Kính hiển vi quang học;

- Sổ ghi kết quả, hộp thuốc chống sốc, ống nghe, máy đo huyết áp;

- Máy tính, máy in; đầu quét mã vạch;

- Tủ lưu tiêu bản; tủ lưu hồ sơ;

- Thùng đựng rác thải y tế, thùng đựng rác thải thường.

2.4. Người bệnh

- Người bệnh được giải thích về quy trình thực hiện, mục đích, nguy cơ, lợi ích để người bệnh yên tâm và hợp tác làm xét nghiệm;

- Khai thác tiền sử người bệnh có yếu tố dị ứng;

- Hướng dẫn người bệnh phối hợp để lấy mẫu theo đúng yêu cầu;

- Người bệnh ở tư thế thoải mái, phù hợp với cách lấy bệnh phẩm.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm có đầy đủ các mục: họ tên, tuổi, số giường (đối với người bệnh nội trú), khoa, chẩn đoán, vị trí lấy bệnh phẩm, số lượng;

- Kiểm tra người bệnh: Đúng người bệnh, đúng chỉ định, đúng mắt cần làm xét nghiệm.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: khoảng 45 – 60phút

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Thực hiện tại khoa Xét nghiệm hoặc khoa Giải phẫu bệnh – Tế bào bệnh học.

3. AN TOÀN

- Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo quy trình về an toàn xét nghiệm.

- Xem tất cả các mẫu bệnh phẩm như là nguồn nhiễm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện:

Bước 1: Lấy bệnh phẩm

- Người bệnh nằm trên giường lấy bệnh phẩm.

- Tra 1-2 giọt thuốc gây tê bề mặt nhãn cầuhoặc thuốc tương đương vào kết mạc cùng đồ dưới mắt cần lấy bệnh phẩm trước lúc làm xét nghiệm từ 1 đến 2 phút.

a. Lấy bệnh phẩm kết mạc

- Bộc lộ kết mạc mi trên.

- Dùng curette vô trùng nạo nhẹ kết mạc. Khi nạo để lấy được tế bào biểu mô, kết mạc phải hơi trắng tránh để chảy máu nhiều.

b. Lấy bệnh phẩm giác mạc

- Đặt vành mi hoặc dùng ngón tay cái và ngón tay trỏ vành mắt của người bệnh.

- Dùng Curette vô trùng hoặc dao mổ số 15 hoặc Kimura,s spatula nạo nhẹ từ bờ ổ loét vào trung tâm hoặc đáy ổ loét tuỳ theo yêu cầu của bác sĩ chỉ định và tính chất của tổn thương.

Bước 2: Làm phiến đồ:

- Phết bệnh phẩm lên lam kính sạch tiệt trùng bằng ngọn lửa đèn cồn đã ghi sẵn tên người bệnh.

- Dàn bệnh phẩm theo đường xoắn ốc từ trong ra ngoài, đảm bảo bệnh phẩm được dàn mỏng, đều.

Bước 3: Cố định phiến đồ

Cố định bằng dung dịch phù hợp lên toàn bộ lam kính có chứa bệnh phẩm trước khi nhuộm (dung dịch cố định tuỳ phương pháp nhuộm).

Bước 4: Nhuộm phiến đồ

Theo một trong các phương pháp nhuộm: Giemsa, Papanicolaou, Diff - Quick hay May Grünwanld Giemsa, Ziehl – Neelsen hoặc Hematoxylin Eosin như đã nêu ở mục nhuộm phiến đồ tế bào học.

4.2. Nhận định kết quả

- Nhận định kết quả trên kính hiển vi quang học

+ Các phiến đồ giàu tế bào, được giàn mỏng, đều, các tế bào không chồng chất lên nhau.

+ Hình thái các tế bào được bảo tồn tốt.

+ Các tế bào bắt màu rõ ràng, phân biệt được rõ hình thái của nhân và bào tương.

+ Bạch cầu đoạn trung tính có những hatk to nhỏ không đều màu xanh lơ tới đỏ, Bạch cầu ái toan màu đỏ.

+ Các loại tế bào khác nhân màu tím đỏ, bào tương xanh nhạt.

+ Các thể vùi Chlamydia, vi khuẩn, nấm và Acanthamoeba bắt màu xanh tím.

- Kết luận sau khi phân tích hình thái tế bào.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

- Trả kết quả chính xác ghi chép rõ ràng kết quả và các thông tin quy định vào phiếu trả lời kết quả và sổ kết quả xét nghiệm.

- Lưu kết quả theo quy định của Bộ Y tế.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

- Người bệnh không hợp tác: thuyết phục, giải thích.

5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật:

- Người bệnh bị đau, chảy nhiều nước mắt, mắt không cố định nên khó thực hiện kỹ thuật: do lượng thuốc tê chưa đủ hoặc thời gian tra thuốc cho người bệnh đến khi thực hiện kỹ thuật nhanh, tra thêm thuốc tê hoặc tra thuốc tê theo đúng thời gian quy định.

- Người bệnh không hợp tác: thuyết phục, giải thích.

5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật

- Quá ít tế bào hoặc không lấy được tế bào của tổn thương: do ổ loét giác mạch quá mỏng hoặc dọa thủng.

- Tiêu bản dàn quá dày hoặc phết quá mạnh làm các tế bào chồng chất hoặc bị kéo dài, nát: dàn nhẹ nhàng đều tay.

- Cố định kém làm tế bào thoái hóa không nhận định được hình thái nhân và bào tương: giải thích cho người bệnh lấy bệnh phẩm làm lại xét nghiệm, cố định ngay sau khi dàn tiêu bản.

- Cặn thuốc nhuộm còn trên phiến đồ cần lọc thuốc nhuộm trước khi dùng, rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy.

- Các tế bào bắt màu quá kém: do cố định không tốt, do thuốc nhuộm pha chưa đúng tỷ lệ, hoặc không nhuộm đủ thời gian. Kiểm tra lại thuốc nhuộm, nhuộm đủ thời gian.

- Nhuộm quá đậm: tẩy bớt thuốc nhuộm bằng cồn tuyệt đối.

- Các tế bào bị kéo dài hoặc bị dập nát: cần thực hiện đúng kỹ thuật.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Vi sinh vật y học (2016), Bộ Y tế.

2. Thực tập Vi sinh vật Y học, Bộ môn Vi sinh, trường Đại học Y Hà Nội.

3. Hướng dẫn quy trình kỹ thuật xét nghiệm Vi sinh lâm sàng ban hành kèm theo quyết định số 1539/QĐ-BYT ngày 20/4/2017.

4. Bộ Y tế (2016), Quy trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh, Tế bào học các quy trình kỹ thuật tế bào học, Nhà xuất bản Y học, trang 379-457.

5. Ocular Microbiology. Aravind Eye Hospitals and Postgraduate Insitute of Ophthalmology Madurai, India.

6. Diagnostic technologies in Ophthalmology. Bentham Books, 2012.

8. QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ BÀO HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM PAPANICOLAOU

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Phương pháp nhuộm tế bào được sử dụng đặc biệt trong sàng lọc ung thư cổ tử cung và trong chẩn đoán ở mức độ tế bào của các bướu đặc. Phương pháp này cho phép đánh giá chi tiết cấu trúc tế bào, bào tương và nhân, từ đó hỗ trợ quá trình chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh lý.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

- Nhuộm Papanicolaou còn được gọi là “nhuộm PAP”, là một loại kỹ thuật Tế bào học nhuộm đa sắc, dùng để phân biệt tế bào trên phiến đồ được lấy từ các dịch hoặc từ tế bào bong của cơ thể. Dạng kinh điển của nhuộm PAP gồm 5 loại phẩm màu, được pha thành 3 dung dịch:

- Hematoxylin (phẩm nhuộm base): nhuộm nhân tế bào

- Orang G (gồm acid photphotungstic và OG-5, OG-8): nhuộm chất keratin có trong tế bào.

- Phẩm EA (Eosin Azure): gồm 3 loại phẩm (EA-36, EA-50, EA-65). Eosin Y nhuộm các tế bào vảy bề mặt, hạt nhân, hồng cầu. Xanh lá cây nhạt SF (Light Green). Ánh vàng dùng để nhuộm bào tương của các loại tế bào khác (tế bào vảy không sừng hóa). Nâu Bismarck Y do không nhuộm thành phần nào nên trong công thức nhuộm hiện tại, một số phòng xét nghiệm đã bỏ đi.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý.

2.2. Vật tư, hóa chất:

- Dung dịch cố định bệnh phẩm: Cồn tuyệt đối, cồn ete…

- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm PAP, EA50, Orange...

- Nước cất, nước sạch để rửa thuốc nhuộm trên phiến kính.

- Bể nhuộm, khay đựng tiêu bản, lam kính, phiến kính, keo gắn phiến kính...

2.3. Trang thiết bị:

- Máy nhuộm tiêu bản tự động.

- Kính hiển vi quang học, bàn có mặt phẳng, đủ rộng để đặt kính hiển vi

- Sổ hoặc máy tính ghi lại thông tin của từng Người bệnh, đặc điểm tổn thương, kết quả chẩn đoán.

- Thùng rác thải y tế, rác thải thường.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Lấy bệnh phẩm:

+ Việc lấy mẫu được thực hiện bởi các khoa lâm sàng và gửi bệnh phẩm về phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh.

+ Phiến đồ được cố định ngay trong cồn tuyệt đối hoặc cồn - ete: 30 giây

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Phiếu xét nghiệm ghi rõ họ và tên người bệnh, vị trí lấy bệnh phẩm, màu sắc, thời gian lấy, người thực hiện kỹ thuật, số lượng phiến đồ...

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 60 phút.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

+ Chuyển liên tục trong các bể cồn 80º, 70º rồi 50º, mỗi bể 5 lần nhúng

+ Rửa nước cất

+ Nhuộm nhân trong hematoxylin Harris: 3 - 6 phút

+ Rửa nước cất

+ Nhúng 5 - 6 lần trong dung dịch acid HCl 0,25%

+ Rửa nước chảy trong 6 phút rồi qua nước cất khoảng 30 giây

+ Chuyển liên tục trong các bể cồn 50º, 70º, 80º rồi 95º: mỗi bể 5 lần nhúng

+ Nhỏ Orange G phủ kín bệnh phẩm: khoảng 1 - 3 phút

+ Chuyển liên tục qua 2 bể cồn 95º: mỗi bể 5 lần nhúng

+ Nhuộm trong hỗn hợp đa sắc “EA50” trong khoảng 1 - 4 phút

+ Chuyển liên tục trong các bể cồn 95º rồi 100º: mỗi bể 5 lần nhúng

+ Khử nước bằng cồn 95° và 100°

+ Làm trong bằng 3 bể toluen sạch

+ Gắn lá kính bằng bôm như thường lệ.

- Kết quả

+ Nhân: xanh xám hoặc tím

+ Bào tương tế bào ưa acid: đỏ hồng, đỏ tươi hoặc vàng da cam

+ Các tế bào ưa base: xanh nhạt, đôi khi xanh ve nhạt.

4.2. Nhận định kết quả

Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh:

+ Đánh giá loại tế bào, hình thái, cấu trúc, đánh giá nền, mô đệm

+ Phân loại tổn thương: viêm, tổn thương u lành, u ác tính, phân típ,...

+ Chẩn đoán tế bào theo các hệ thống phân loại được khuyến cáo (hệ thống phân loại Bethesda, ....)

+ Phiên giải kết quả cần kết hợp với các thông tin lâm sàng, cận lâm sàng bác sĩ lâm sàng cung cấp hoặc xem bệnh án. Các kết quả có giá trị cảnh báo (Ví dụ: nghi ngờ ác tính) cần được ghi vào phiếu kết quả xét nghiệm hoặc báo cho bác sĩ khám, điều trị.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Phiến đồ bị mất tế bào vào trong dịch cố định: cần để khô sau khi dàn 10-30 phút trước khi cố định bằng cồn.

- Bong bệnh phẩm: rửa nhẹ nhàng, nên dùng phiến kính có phủ chất chống bong

- Các tế bào dày, chồng chất: lấy lượng dịch vừa đủ, dàn đều tay

- Các tế bào bắt màu quá kém: cần cố định tốt và nhuộm đủ thời gian, thuốc nhuộm tốt

- Nhuộm quá đậm: tẩy bớt thuốc nhuộm bằng cồn tuyệt đối.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

2. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

9. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HAI MÀU HEMATOXYLIN - EOSIN TIÊU BẢN TẾ BÀO HỌC

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả và hướng dẫn quy trình, cách thực hiện xét nghiệm và chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm HE (Hematoxylin – Eosin) trên phiến đồ tế bào học.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Phương pháp nhuộm này áp dụng cho tất cả các phiến đồ tế bào học chọc hút kim nhỏ, tế bào bong và phiến đồ áp nhuộm thường quy, phiến đồ tế bào học dịch. Tương tự như quy trình nhuộm HE trên mẫu mô, đây cũng là phương pháp nhuộm phối hợp đơn giản hai phẩm màu liên tiếp, một phẩm màu có tính baze là Hematoxylin để nhuộm nhân, một phẩm màu có tính acid là Eosin để nhuộm bào tương.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý.

2.2. Hóa chất, Vật tư:

- Cồn methanol

- Xylen (toluen)

- Hematoxylin, Eosin

- Acid HCL, Lithiumcarbonat

- Keo gắn lamen

- Lam kính, lamen

- Găng tay vô trùng, khẩu trang.

- Ống hút tự động.

- Ống đựng mẫu ly tâm

- Giá để đựng lam kính đã dàn bệnh phẩm.

- Bút chì mềm ghi mã số người bệnh, vị trí chọc hút.

- Các dụng cụ để nhuộm: khay, giá, cốc pha thuốc nhuộm, ống hút.

2.3. Trang thiết bị:

- Máy ly tâm

- Kính hiển vi quang học, bàn có mặt phẳng, đủ rộng để đặt kính hiển vi

- Máy tính, máy in.

- Máy đo pH.

- Máy nhuộm tiêu bản tự động

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Lấy bệnh phẩm: mẫu bệnh phẩm được thu thập từ các kỹ thuật chọc hút kim nhỏ, áp lam tế bào bong hoặc trên các dịch cơ thể.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 1h30 phút.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản cố định bằng cồn tuyệt đối hoặc cồn ete, để khô

+ Rửa nước: nhúng 15 lần.

+ Nhuộm nhân bằng Hematoxylin: 3-5 phút hoặc lâu hơn.

+ Rửa nước chảy: 5-10 phút.

+ Kiểm tra màu của nhân qua kính hiển vi, nếu đậm, tẩy nhẹ bằng cồn-acid.

+ Rửa nước chảy: 1 phút.

+ Nhuộm Eosin1%: 1 -2 phút.

+ Rửa nước chảy: 1 phút.

+ Biệt hoá trong 2 bể cồn 95º - 100º, mỗi bể 15 lần nhúng.

+ Qua 3 bể toluen, bể I và II nhúng 15 lần, bể III: 5-10 phút.

+ Gắn lamen

- Ngoài ra, tiêu bản sau khi cố định, để khô có thể nhuộm bằng máy nhuộm tiêu bản tự động theo quy trình cài đặt sẵn.

- Kết quả:

Nhân tế bào: xanh đến xanh đen

Bào tương tế bào: hồng đến đỏ

Hồng cầu: hồng đậm

Sợi tạo keo: hồng nhạt

4.2. Nhận định kết quả

Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi

Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh:

+ Đánh giá loại tế bào, hình thái, cấu trúc, đánh giá nền, mô đệm

+ Phân loại tổn thương: viêm, tổn thương u lành, u ác tính, phân típ,...

+ Chẩn đoán tế bào theo các hệ thống phân loại được khuyến cáo (hệ thống phân loại Bethesda, ....)

+ Phiên giải kết quả cần kết hợp với các thông tin lâm sàng, cận lâm sàng bác sĩ lâm sàng cung cấp hoặc xem bệnh án. Các kết quả có giá trị cảnh báo (Ví dụ: nghi ngờ ác tính) cần được ghi vào phiếu kết quả xét nghiệm hoặc báo cho bác sĩ khám, điều trị.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Bào tương và nhân đều bắt màu nhạt: thuốc nhuộm cũ, thay thuốc nhuộm mới.

- Nhân nhạt màu: tăng thời gian nhuộm nhân.

- Nhân đậm màu quá mức: tẩy nhẹ bằng cồn-acid.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

10. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ BÀO HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẾ BÀO HỌC CHẤT LỎNG (LIQUID – BASED CYOTLOGY)

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán xét nghiệm và chẩn đoán kỹ thuật tế bào học chất lỏng trong đó bao gồm cả bệnh phẩm tế bào học các loại dịch cơ thể và tế bào bong như tế bào cổ tử cung – âm đạo.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Phương pháp này nhằm nâng cao hiệu quả phát hiện sớm các tế bào tiền ung thư, ung thư cổ tử cung. Đây là kỹ thuật tế bào không ảnh hưởng đến môi trường, thiết bị đơn giản, có thể lưu trữ bệnh phẩm để xét nghiệm lại khi cần (không phải mời người bệnh đến lấy lại bệnh phẩm tế bào như các phương pháp khác), có thể sử dụng bệnh phẩm cho phân tích các thụ thể, gen, các tác nhân gây bệnh, hóa miễn dịch tế bào… chỉ trong 1 lần lấy bệnh phẩm. Dùng các hóa chất hòa tan chất nhầy và hồng cầu để các thành phần này không che lấp các tế bào cần quan sát, cũng như dùng chất dính để các tế bào như được dán lên lam kính, không bị trôi khi nhuộm. Các tế bào không bị chồng chất lên nhau, nên rất dễ quan sát, do đó tăng độ nhạy, độ chính xác, giảm tỷ lệ âm tính giả.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư, hóa chất

- Các ống ly tâm, lọ đựng bệnh phẩm có chất cố định.

- Ống hút tự động loại 20 đến 200µ và loại 500 đến 6000µ.

- Dung dịch làm sạch.

- Lam kính có gẵn sẵn chất chống bong, lamen sạch.

- Hộp đựng phiến đồ

- Cồn 50°, 70°, 80°, 90°. 95°, 100°.

- Dung dịch cố định phù hợp

- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm phiến đồ (Giemsa/Diff - Quick/ Hematoxylin&Eosin/ Papanicolaou, Ziehl - Neelsen…).

- Nước cất, nước sạch để rửa thuốc nhuộm trên lam kính.

2.3. Trang thiết bị

- Máy ly tâm, tốc độ từ 100°-2000 vòng/phút.

- Máy tách chiết tế bào tự động (Thinprep, Surethin, Surepath…)

- Ống hút tự động loại 20 đến 200µ và loại 500 đến 6000µ.

- Kính hiển vi quang học (có gắn camera).

- Dụng cụ sấy tiêu bản;

- Hệ thống máy tính, máy in, đầu quét mã vạch;

- Tủ lưu tiêu bản, lưu hồ sơ;

- Thùng rác đựng rác thải y tế và rác thải thường.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Việc lấy mẫu được thực hiện bởi các khoa lâm sàng và gửi bệnh phẩm về Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 60 phút

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn Phòng xét nghiệm

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

Bước 1: Kỹ thuật tập trung tế bào: Bệnh phẩm sau khi nhận sẽ được trộn đều, ly tâm và hút tế bào phết trên lam kính chống bong. Việc thực hiện tự động trên hệ thống tách chiết tế bào, theo hướng dẫn của từng hệ thống.

Yêu cầu: Tế bào lấy được phải đảm bảo đủ số lượng và thành phần, loại trừ một phần hồng cầu hoặc tế bào viêm, tạo chất.

Bước 2: Cố định phiến đồ:

- Cố định bằng dung dịch phù hợp lên toàn bộ bề mặt lam kính có chứa bệnh phẩm trước khi nhuộm (tuỳ phương pháp nhuộm).

Bước 3: Nhuộm phiến đồ Theo một trong các phương pháp nhuộm: Giemsa, Papanicolaou, Diff - Quick hay May Grünwanld Giemsa, Ziehl – Neelsen hoặc Hematoxylin Eosin).

4.2. Nhận định kết quả

Phiến đồ sau khi nhuộm màu xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh:

+ Đánh giá loại tế bào, hình thái, cấu trúc, đánh giá nền, mô đệm

+ Phân loại tổn thương: viêm, tổn thương u lành, u ác tính, phân típ,...

+ Chẩn đoán tế bào theo các hệ thống phân loại được khuyến cáo (hệ thống phân loại Bethesda, ....)

+ Phiên giải kết quả cần kết hợp với các thông tin lâm sàng, cận lâm sàng bác sĩ lâm sàng cung cấp hoặc xem bệnh án. Các kết quả có giá trị cảnh báo (Ví dụ: nghi ngờ ác tính) cần được ghi vào phiếu kết quả xét nghiệm hoặc báo cho bác sĩ khám, điều trị.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định tại cơ sở

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

Cần xem xét lượng tế bào nhiều hay ít để pha dung dịch chất dính (cell base). Nếu mật độ tế bào thấp, cần dùng ít dung dịch cell base để có đủ tế bào chẩn đoán.

Lưu ý thời gian nhuộm nhân, không để quá dài, vì nếu nhuộm nhân lâu sẽ làm tăng sắc, có thể dẫn đến nhận định sai.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

2. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

11. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN TẾ BÀO TRONG CÁC LOẠI DỊCH CƠ THỂ BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẾ BÀO HỌC CHẤT LỎNG (Non Gyn)

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả và hướng dẫn cách thực hiện xét nghiệm Tế bào học các loại dịch trong cơ thể bằng kĩ thuật tế bào học chất lỏng (Liquid base cytology).

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Tế bào học chất lỏng là một phương pháp xét nghiệm tế bào thay vì phết trực tiếp bệnh phẩm trên lam kính như xét nghiệm tế bào truyền thống thường, mẫu bệnh phẩm trong xét nghiệm tế bào học chất lỏng được lấy vào các lọ có chứa dung dịch bảo quản có sẵn, chất lỏng được xử lí loại bỏ chất nhày và hồng cầu. Tại phòng xét nghiệm sẽ sử dụng hệ thống thiết bị có màng lọc, chất dính tế bào để phết một lớp tế bào lên lam kính để xét nghiệm. Các tế bào không bị trôi hoặc chồng chất lên nhau, nên rất dễ quan sát, do đó tăng độ nhạy, độ chính xác, giảm tỷ lệ âm tính giả.

Phương pháp này nhằm nâng cao hiệu quả phát hiện sớm các tế bào tiền ung thư, ung thư. Đây là kỹ thuật tế bào không ảnh hưởng đến môi trường, thiết bị đơn giản, có thể dùng bệnh phẩm để làm nhiều xét nghiệm khác (như phân tích các thụ thể, gen, các tác nhân gây bệnh, hóa miễn dịch tế bào…) chỉ trong 1 lần lấy bệnh phẩm. Đồng thời có thể lưu trữ bệnh phẩm để xét nghiệm lại khi cần (không phải mời người bệnh đến lấy lại bệnh phẩm tế bào như các phương pháp khác).

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Nhân lực trực tiếp

+ Bác sĩ: 01

+ Kỹ thuật y: 01.

- Nhân lực hỗ trợ:

+ Nhân viên hành chính;

+ Hộ lý, nhân viên vệ sinh.

2.2. Vật tư, hóa chất

2.2.1. Hoá chất

- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm phiến đồ (Giemsa/Diff - Quik/HE/ Papanicoulou, Ziehl - Neelsen…);

- Nước cất, nước sạch để rửa thuốc nhuộm trên phiến kính;

- Cồn 80°, 90° và cồn tuyệt đối;

- Dung dịch rửa tay thường quy.

2.2.2. Vật tư tiêu hao

Vật tư tiêu hao:

- Lam kính sạch có chất chống bong, một đầu mài mờ để ghi thông tin người bệnh;

- Lamelle (lá kính);

- Bộ lấy mẫu bệnh phẩm chuyên dụng: lọ chứa dung dịch đựng bệnh phẩm (có sẵn chất cố định và chất làm sạch), chổi quét lấy mẫu.

- Bơm tiêm vô trùng 10ml hoặc 20ml và Kim tiêm loại 23G hoặc 27G (các trường hợp lấy dịch trong các tổn thương dạng nang);

- Bộ dụng cụ nhuộm lam kính;

- Ống hút tự động loại 20 đến 200µ và loại 500 đến 6000µ;

- Các ống ly tâm;

- Bông khô tiệt trùng;

- Băng dính y tế;

- Găng tay sạch, khẩu trang, mũ y tế;

- Giấy/khăn lau tay;

- Giấy A4; sổ bàn giao bệnh phẩm.

- Bút dạ dầu, bút chì mềm, bút bi;

Dụng cụ:

- 2 Khay quả đậu đựng dụng cụ, vật tư sạch và vật tư đã sử dụng;

- Hộp đựng bông cồn sát trùng và hộp đựng bông khô tiệt trùng;

- Hộp bằng thép không rỉ đựng bơm, kim tiêm sạch;

- Hộp chống sốc;

- Khay/giá để tiêu bản;

- Túi rác thải y tế; túi rác thải thông thường;

- Hộp đựng rác thải sắc nhọn;

- Thùng đựng rác thải y tế (màu vàng) và thông thường (màu xanh).

2.3. Trang thiết bị

- Máy ly tâm, tốc độ từ 100°-2000 vòng/phút.

- Máy tách chiết tế bào tự động.

- Ống hút tự động loại 20 đến 200µ và loại 500 đến 6000µ.

- Kính hiển vi quang học (có gắn camera).

- Dụng cụ sấy tiêu bản;

- Hệ thống máy tính, máy in, đầu quét mã vạch;

- Tủ lưu tiêu bản, lưu hồ sơ;

- Thùng rác đựng rác thải y tế và rác thải thường.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

2.4.1. Lấy mẫu bệnh phẩm

- Bệnh phẩm tế bào một số vị trí như cổ tử cung – âm đạo, khoang miệng, tế bào bong ở da,… có thể dùng dụng cụ lấy mẫu chuyên dụng (chổi quét) để lấy mẫu, nhúng vào lọ đựng dung dịch cố định.

- Các loại dịch như dịch màng phổi, dịch màng bụng, dịch não tủy,… được lấy tại các phòng thủ thuật, chứa trong các lọ đựng, bảo quản lạnh nếu chưa được vận chuyển đến phòng tế bào.

- Các mẫu phẩm tế bào khác có thể được lấy mẫu bằng các kĩ thuật chọc hút tế bào tại phòng thủ thuật hoặc phòng xét nghiệm tế bào; cho mẫu dịch vào các lọ chứa dung dịch cố định.

2.4.2. Bàn giao mẫu

- Các mẫu bệnh phẩm được bàn giao đến phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh tế bào ngay trong ngày.

- Trên các lọ chứa mẫu phẩm ghi đầy đủ thông tin người bệnh: tên, tuổi, mã số, mã vạch. Các thông tin phù hợp với chỉ định xét nghiệm.

- Các lọ bệnh phẩm được đóng nắp, không tràn lắc bệnh phẩm. Nếu tràn lắc bệnh phẩm cần lấy lại bệnh phẩm để thực hiện xét nghiệm.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân, tên khoa phòng, chẩn đoán, kết quả khám lâm sàng và tiền sử của bệnh nhân, thời gian lấy mẫu, số lượng mẫu.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng, phương pháp lấy mẫu, vị trí, số lượng mẫu.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến khoa xét nghiệm.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 40 phút

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật:

Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh – tế bào

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm:

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Làm tiêu bản

- Khởi động hệ thống.

- Đặt lọ chứa bệnh phẩm vào vị trí quy định trên máy.

- Đặt lam kính vào giá cài trên máy.

- Cài màng lọc.

- Chọn chương trình.

- Ấn start.

- Sau khi chạy xong chương trình , nhấc lam kính ra và nhuộm theo quy trình.

- Bỏ lọ đựng bệnh phẩm vào vị trí lưu trữ và hủy bỏ theo quy trình quy định.

4.2. Nhuộm lam kính tế bào

- Theo một trong các phương pháp nhuộm: Giemsa, Papanicolaou, Diff - Quick hay May Grünwanld Giemsa, Ziehl – Neelsen hoặc HE).

- Lựa chọn phương pháp nhuộm tuỳ mục đích làm xét nghiệm.

4.3. Nhận định kết quả

- Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ Giải phẫu bệnh.

- Đánh giá chất lượng tiêu bản: màu sắc, mật độ tế bào trên tiêu bản nhuộm.

Tiêu bản chất lượng tốt.

+ Các tế bào tập trung chủ yếu ở trung tâm tiêu bản, lớp tế bào mỏng đều.

+ Các tế bào bắt màu rõ nhân và bào tương: nhân tím xanh, bào tương hồng nhạt, hồng cầu xanh nhạt.

- Đọc và nhận định kết quả:

+ Đánh giá loại tế bào, hình thái, cấu trúc, đánh giá nền, mô đệm

+ Phân loại tổn thương: viêm, tổn thương u lành, u ác tính, phân típ,...

+ Một số vị trí có thể chẩn đoán tế bào theo các hệ thống phân loại được khuyến cáo như tuyến giáp, cổ tử cung có hệ thống phân loại Bethesda, ....

+ Phiên giải kết quả cần kết hợp với các thông tin lâm sàng, cận lâm sàng bác sĩ lâm sàng cung cấp hoặc xem bệnh án. Các kết quả có giá trị cảnh báo (Ví dụ: nghi ngờ ác tính) cần được ghi vào phiếu kết quả xét nghiệm hoặc báo cho bác sĩ khám, điều trị.

4.4. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

- Báo cáo kết quả: vào kết quả trên phần mềm máy tính, in và ký kết quả bản cứng.

- Lọ chứa mẫu bệnh phẩm và tiêu bản thực hiện xét nghiệm lưu trữ đúng vị trí và hủy theo quy định.

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

- Sai sót về tủ tục hành chính: Phiếu và lọ xét nghiệm không khớp tên, thiếu thông tin bệnh phẩm.... Cần kiểm tra đầy đủ thông tin họ tên đầy đủ, tuổi của bệnh nhân đối chiếu mẫu bệnh phẩm trước khi thực hiện xét nghiệm và liên hệ với bác sĩ lâm sàng.

- Sai phiếu chỉ định xét nghiệm: Nhân viên phòng xét nghiệm kiểm tra đúng loại phiếu, nếu sai cần báo cho bác sĩ và người thực hiện.

5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật

- Sự cố do máy: máy rung lắc mạnh, kêu...Vận hành máy đúng quy trình.

- Phiến đồ bị mất tế bào trong quá trình cố định: cần để khô sau khi dàn 10-30 phút trước khi cố định bằng cồn tuyệt đối.

- Bong bệnh phẩm: rửa nhẹ nhàng, nên dùng lam kính có phủ chất chống bong

- Các tế bào dày, chồng chất: lấy lượng dịch vừa đủ, dàn đều tay

- Tế bào thoái hóa, tan rã, không nhận định được hình thái nhân và bào tương: dịch lấy ra khỏi cơ thể phải làm xét nghiệm ngay.

- Các tế bào bắt màu quá kém: cần cố định tốt và nhuộm đủ thời gian, thuốc nhuộm tốt.

- Nhuộm quá đậm: tẩy bớt thuốc nhuộm bằng cồn tuyệt đối.

- Các tế bào bị kéo dài hoặc bị dập nát: cần thực hiện đúng kỹ thuật.

- Nhầm tiêu bản giữa các bệnh nhân: Cần đối chiếu đúng tên người bệnh trên lam kính.

5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật

Nhầm bệnh nhân khi vào kết quả xét nghiệm : Kiểm tra kỹ phiếu chỉ định và tiêu bản của bệnh nhân, ghi mô tả/ chẩn đoán trên phiếu chỉ định trước khi vào kết quả trên máy.

Nếu có 2 bệnh nhân trùng tên toàn bộ, cần đối chiếu thêm thông tin khác (tuổi, địa chỉ, mã y tế).

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

2. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

3. Freida Carson: Histotechnoloy, 3rd editon, 2017.

13. QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM TẾ BÀO TÌM TINH THỂ URAT QUA KÍNH HIỂN VI PHÂN CỰC

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện xét nghiệm và chẩn đoán tế bào học tìm tinh thể urat qua kính hiển vi phân cực

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Xét nghiệm dịch khớp, quan sát phát hiện tinh thể urat giúp bác sĩ chẩn đoán chính xác bệnh Gout. Xét nghiệm này giúp đánh giá tổn thương các khớp, từ đó xác định mức độ viêm và có biện pháp xử lý kịp thời.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư, hóa chất

- Găng tay vô trùng, khẩu trang.

- Pipet nhựa

- Lam kính sạch, một đầu mài mờ.

- Giá để đựng lam kính đã dàn bệnh phẩm.

- Bút chì mềm ghi mã số người bệnh, vị trí chọc hút.

- Các dụng cụ để nhuộm: khay, giá, cốc pha thuốc nhuộm, ống hút.

- Phiếu xét nghiệm ghi rõ họ và tên người bệnh, vị trí lấy dịch, số lượng dịch, màu sắc, thời gian lấy, người thực hiện kỹ thuật, số lượng phiến đồ.

- Dung dịch cố định phù hợp

- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm phiến đồ (Giemsa/Diff – Quick/ Hematoxylin Eosin/ Papanicolaou/ Ziehl - Neelsen…).

- Các dung dịch sát khuẩn.

- Nước cất, nước sạch để rửa thuốc nhuộm trên lam kính.

2.3. Trang thiết bị

- Bàn sấy tiêu bản;

- Kính hiển vi quang học (có gắn camera chụp ảnh vi thể);

- Máy tính, máy in; đầu quét mã vạch;

- Tủ lưu tiêu bản; tủ lưu hồ sơ;

- Thùng rác đựng rác thải y tế và rác thải thường.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Lấy bệnh phẩm: Việc lấy mẫu được thực hiện bởi các khoa lâm sàng và gửi bệnh phẩm về Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh.

Yêu cầu: dịch hút ra được dàn lên lam kính, để khô tự nhiên, sau đó cố định

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 30 phút

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn Phòng xét nghiệm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

Bước 1: Cố định phiến đồ:

- Cố định bằng dung dịch phù hợp lên toàn bộ bề mặt lam kính có chứa bệnh phẩm trước khi nhuộm (tuỳ phương pháp nhuộm).

Bước 2: Nhuộm các phiến đồ

- Theo một trong các phương pháp nhuộm: Giemsa, Papanicolaou, Diff - Quick hay May Grünwanld Giemsa, Ziehl – Neelsen hoặc Hematoxylin Eosin như đã nêu ở mục nhuộm phiến đồ tế bào học).

4.2. Nhận định kết quả

- Phiến đồ sau khi nhuộm màu xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định tại co sở.

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

- Phiến đồ bị mất tế bào vào trong dịch cố định: cần để khô sau khi dàn 10-30 phút trước khi cố định

- Bong bệnh phẩm: rửa nhẹ nhàng, nên dùng lam kính có phủ chất chống bong

- Các tế bào dày, chồng chất: lấy lượng dịch vừa đủ, dàn đều tay

- Tế bào thoái hóa, tan rã, không nhận định được hình thái nhân và bào tương: dịch lấy ra khỏi cơ thể phải làm xét nghiệm ngay hoặc phải tiền cố định.

- Các tế bào bắt màu quá kém: cần cố định tốt và nhuộm đủ thời gian, thuốc nhuộm tốt.

- Nhuộm quá đậm: tẩy bớt thuốc nhuộm bằng cồn tuyệt đối.

- Các tế bào bị kéo dài hoặc bị dập nát: cần dàn đúng kỹ thuật.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

2. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

PHẦN II. CÁC QUY TRÌNH NHUỘM MÔ BỆNH HỌC – TẾ BÀO

28. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ĐỎ CONGO KIỀM (THEO PUCHTLER 1962)

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả và hướng dẫn quy trình, cách thực hiện và chẩn đoán kỹ thuật nhuộm đỏ

Congo kiềm (theo Puchtler 1962)

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Đỏ Congo là phẩm nhuộm acid nhóm diazo, gồm hai nửa giống nhau, trong đó, mỗi nửa có vòng phenol gắn với nhóm phân tử naphtalen nhờ nhóm diazo. Hai nhómphenyl gắn với nhau bằng liên kết diphenyl. Tuy nhiên, việc nhuộm chất dạng tinh bột (amyloid) bằng đỏ Congo là nhờ liên kết hydrogen khác với liên kết hóa điện tử được tạo ra giữa phẩm nhuộm và hầu hết các thành phần mô được nhuộm. Trong dung dịch nước, đỏ Congo nhuộm nhiều thành phần mô khác nhau, mặc dù ái lực với chất dạng tinh bột lớn hơn đối với thành phần khác.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư, hóa chất

Vật tư, hóa chất dùng cho nhuộm tự động

- Lamen , keo gắn lamen

- Lam kính có chất chống bong

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Dung dịch tẩy nến

- Dung dịch dầu khoáng

- Dung dịch rửa

- Bộ kít nhuộm đỏ Congo

Vật tư, hóa chất dùng cho nhuộm tay

- Lamen , keo gắn lamen

- Lam kính sạch

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Cồn 70°, 80° , 95°, 100°

- Xylen hoặc Toluen

- Dung dịch A lưu trữ: Chlorit sodium bão hòa trong 80% etanol.

- Dung dịch B lưu trữ: đỏ Congo bão hòa trong 80% etanol được bão hòa bằng chlorit sodium.

- 1% dung dịch nước hydroxit sodium. Dung dịch làm việc

- 100 ml dung dịch A lưu trữ thêm 1 ml dung dịch nước hydroxit sodium 1% rồi lọc.

- 100ml dung dịch B lưu trữ thêm 1ml dung dịch nước hydroxit sodium 1% rồi lọc.

2.3. Trang thiết bị

- Máy cắt lát mỏng

- Kính hiển vi quang học

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Máy nhuộm đặc biệt

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm là mẫu mô đã vùi paraffin

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 2 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn Phòng xét nghiệm

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

Nhuộm máy:

- Bước 1: Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

- Bước 2: Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

- Bước 3: Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

- Bước 4: Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

Nhuộm tay:

- Bước 1: Tẩy parafin mảnh cắt bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút

- Bước 2: Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút

- Bước 3: Rửa trong nước cất 3 – 5phút

- Bước 4: Nhuộm nhân trong alun hematoxylin, biệt hóa và làm xanh

- Bước 5: Nhúng trong dung dịch chlorit sodium kiềm x 20 phút

- Bước 6: Chuyển ngay sang dung dịch đỏ Congo kiềm x 20 phút

- Bước 7: Đẩy nước bằng cồn 95° và 100°

- Bước 8: Làm trong bằng 3 bể toluen sạch

- Bước 9: Gắn lá kính.

Kết quả:

Bác sĩ giải phẫu bệnh phân tích kết quả nhuộm trên kính hiển vi quang học:

+ Chất dạng tinh bột, sợi chun, hạt bạch cầu ưa toan: đỏ

+ Nhân: xanh

4.2. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ theo quy định tại cơ sở

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá.

+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: Kiểm tra dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.

+ Mặc dù dung dịch lưu trữ có khả năng ổn định khoảng 2 tháng, nhưng để có màu sắc tốt, không nên để lưu dung dịch làm việc mà chỉ sử dụng trong khoảng 20 phút sau chuẩn bị.

+ Để bão hòa trong 100ml etanol 80%, cần sử dụng 0,2g phẩm đỏ Congo. Lưu giữ dung dịch trong tủ lạnh

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

2. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

3. Freida Carson: Histotechnoloy, 3rd editon, 2017.

29. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM XANH ALCIAN

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả và hướng dẫn quy trình, cách thực hiện và chẩn đoán kỹ thuật nhuộm xanh Alcian

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Đây là kỹ thuật nhuộm xác định các loại chất nhầy khác nhau (loại acid, trung tính hoặc kiềm, thường được áp dụng cho các tổn thương đường tiêu hóa). Nguyên lý dựa vào tính chất thuốc nhuộm cation và hình thành các liên kết với các anion nhất định trong mô mang nhóm carboxyl hoặc nhóm sunfat, tạo nên các liên kết tĩnh điện cationanion. Gốc photphat của acid nhân không sẵn sàng liên kết với thuốc nhuộm xanh alcian. Có thể nhuộm xanh alcian ở các độ pH khác nhau để phân biệt các chất nhầy acid.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư, hóa chất

Vật tư, hóa chất nhuộm tự động:

- Lamen , keo gắn lamen

- Lam kính có chất chống bông

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Dung dịch tẩy nến

- Dung dịch dầu khoáng

- Dung dịch rửa

- Bộ kít nhuộm đỏ xanh Alcian

Vật tư, hóa chất nhuộm tay:

- Lamen , keo gắn lamen

- Lam kính sạch

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Cồn 70°, 80° , 95°, 100°

- Xylen hoặc Toluen

- Pha dung dịch xanh alcian 1% trong acid acetic 3% (pH 2,5)

+ Xanh alcian 1g

+ Acid acetic 3% 100ml

Hòa tan xanh alcian trong acid acetic. Lọc trước khi sử dụng.

- Pha dung dịch xanh alcian 1% trong acid hydrochloric 0,1M (pH 1,0)

+ Xanh alcian 1g

+ Acid hydrochloric 0,1M 100ml

Hòa tan xanh alcian trong acid hydrochloric. Lọc trước khi sử dụng.

- Pha dung dịch natri carbonat 0,3%

+ Natri cacbonat 0,3 g

+ Nước cất 100ml

2.3. Trang thiết bị

- Máy cắt lát mỏng

- Kính hiển vi quang học

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Máy nhuộm đặc biệt

- Máy đo pH

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm là mẫu mô đã vùi paraffin

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 2 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn Phòng xét nghiệm

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

Nhuộm máy:

- Bước 1: Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

- Bước 2: Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

- Bước 3: Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

- Bước 4: Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

Nhuộm tay:

- Bước 1: Tẩy nến trong toluen 3 lần, mỗi lần 2 phút

- Bước 2: Chuyển vào bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút

- Bước 3: Rửa nước chảy 5 phút

- Bước 4: Đặt trong dung dịch acid acetic 3% trong 2 phút

- Bước 5: Nhuộm trong dung dịch xanh alcian 1%: 30 phút

- Bước 6: Rửa nước chảy 5 phút

- Bước 7: Để trong dung dịch natri carbonat 0,3% trong 30 phút

- Bước 8: Rửa nước chảy 5 phút

- Bước 9: Nhuộm nhân trong Hematoxylin Mayer: 7 phút

- Bước 10: Rửa nước chảy 5 phút

- Bước 11: Loại nước bằng cồn 80°, 95°, 100°.

- Bước 12: Làm trong qua 3 bể toluen.

- Bước 13: Gắn lá kính

Kết quả nhuộm:

Bác sĩ giải phẫu bệnh phân tích kết quả nhuộm trên kính hiển vi quang học: Chất nhầy acid: màu xanh ngọc

Nhân tế bào: màu xanh nhạt

4.2. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ theo quy định tại cơ sở

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

- Mảnh cắt bị bong, gấp quá nhiều:

+ Có thể do cố định bệnh phẩm không tốt: không khắc phục được hoặc phải lấy bệnh phẩm mới và làm lại kỹ thuật.

+ Do cắt dày hoặc dán mảnh cắt không tốt: cắt và dán lại mảnh cắt, nhuộm lại.

+ Mảnh cắt bị rách, nhăn hoặc giãn quá mức: do cắt bị vấp hoặc do dàn mảnh cắt quá mức hoặc bàn hơ quá nóng. Cần điều chỉnh nhiệt độ và cắt nhuộm lại nếu cần.

- Nhân tế bào và chất nhày bắt màu yếu: tăng thời gian nhuộm.

- Nhiều bọt khí, hơi nước trong tiêu bản:gắn lá kính thật nhanh, ngay khi nhấc qua bể toluen, thực hiện kỹ thuật trong phòng khô (có điều hòa, máy hút ẩm, đặc biệt vào những khi thời tiết có độ ảm cao).

- Mảnh cắt bị khô, bay mất thuốc nhuộm, không đánh giá được: cần phủ kín mảnh cắt bằng lá kính, gắn đủ bôm hoặc chất gắn lá kính.

- Chất nhầy acid không bắt màu: kiểm tra lại để đánh giá chính xác độ pH của thuốc nhuộm.

- Tùy thuộc chất nhày acid loại nào sẽ bắt màu ở các độ pH 1 hay 2,5, nên phải đánh giá sự bắt màu chất nhày theo loại mô được nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

2. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

3. Freida Carson: Histotechnoloy, 3rd editon, 2017.

30. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM 3 MÀU CỦA MASSON (1929)

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả và hướng dẫn quy trình, cách thực hiện và chẩn đoán kỹ thuật nhuộm nhuộm ba màu theo Masson (1929)

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Kỹ thuật nhuộm Masson được sử dụng để nhuộm mô liên kết, nơi nó cho phép phân biệt giữa các thành phần của mô như collagen, cái sợi cơ, và các thành phần khác.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư, hóa chất

Vật tư, hóa chất nhuộm tự động

- Lamen , keo gắn lamen

- Lam kính có chất chống bong

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Dung dịch tẩy nến

- Dung dịch dầu khoáng

- Dung dịch rửa

- Bộ kít nhuộm 3 màu Masson

- Cồn 70°, 80°, 95°, 100°

- Xylen hoặc Toluen

- Keo gắn

Vật tư, hóa chất nhuộm tay:

- Lamen , keo gắn lamen

- Lam kính sạch

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Cồn 70°, 80°, 95°, 100°

- Xylen hoặc Toluen

- Cồn – acid 1%

- Hematoxylin

- Ione, sodium thiosulfat.

a. Dung dịch A

Acid fuchsin 0,5g

Acid acetic (rất lạnh) 0,5ml

Nước cất 100ml

b. Dung dịch B

Acid Photphomolybdic 1,0g

Nước cất 100ml

c. Dung dịch C

Xanh metyl 2,0g

Acid acetic rất lạnh 2,5ml

Nước cất 100ml

2.3. Trang thiết bị

- Máy cắt lát mỏng

- Kính hiển vi quang học

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Máy nhuộm đặc biệt

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm là mẫu mô đã vùi paraffin

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 2 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn Phòng xét nghiệm

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

Nhuộm tự động:

- Bước 1: Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

- Bước 2: Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

- Bước 3: Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

- Bước 4: Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

Nhuộm tay:

- Bước 1: Tẩy parafin bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút.

- Bước 2: Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút.

- Bước 3: Rửa Bước trong nước cất 3 - 5 phút

- Bước 4: Loại bỏ vết thủy ngân (nếu có) trong mảnh cắt bằng iodine, sau đó bằng sodium thiosunfat.

- Bước 5: Rửa dưới vòi nước chảy.

- Bước 6: Nhuộm nhân bằng hematoxylin.

- Bước 7: Biệt hoá bằng cồn - acid 1%.

- Bước 8: Rửa kỹ dưới vòi nước chảy.

- Bước 9: Nhuộm bằng dung dịch A (acid fuchsin) x 5 phút.

- Bước 10: Rửa bằng nước cất.

- Bước 11: Xử lý bằng dung dịch B (acid photphomolybdic) x 5 phút.

- Bước 12: Làm ráo nước.

- Bước 13: Nhuộm bằng dung dịch C (xanh metyl) x 2-5 phút.

- Bước 14: Rửa bằng nước cất.

- Bước 15: Xử lý bằng acid acetic 1% x 2 phút.

- Bước 16: Đẩy nước bằng cồn 95° và 100°

- Bước 17: Làm trong tiêu bản bằng 3 bể toluen sạch

- Bước 18: Gắn lá kính

Kết quả:

Bác sĩ giải phẫu bệnh phân tích kết quả nhuộm trên kính hiển vi quang học:

- Nhân: Xanh da trời- đen

- Bào tương, sợi cơ và hồng cầu: Đỏ

- Sợi tạo keo: Xanh da trời

4.2. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ bằng theo quy định tại cơ sở

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá

+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.

+ Khả năng bắt màu phẩm nhuộm tốt trong trường hợp mảnh cắt mô được cố định trong clorua thủy ngân hoặc trong acid picric.

+ Nếu mảnh cắt mô được cố định trong dung dịch formol trung tính, dung dịch Bouin, có khả năng nhuộm màu do hoạt động như chất gắn màu.

+ Nếu mảnh cắt bắt màu quá đỏ, cần biệt hóa trong dung dịch acid acetic 1% được hòa lẫn với 0,7g acid photphotungstic

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

2. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

3. Freida Carson: Histotechnoloy, 3rd editon, 2017.

31. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MAY – GRUNWALD – GIEMSA CHO TUỶ XƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả và hướng dẫn quy trình, cách thực hiện và chẩn đoán kỹ thuật nhuộm May – Grunwald – Giemsa cho tủy xương

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Đây là sự kết hợp giữa hai phương pháp nhuộm Giemsa và May-Grünwald. Hỗn hợp thuốc nhuộm Giemsa và May-Grünwald là sự kết hợp của hỗn hợp có tính acid và kiềm của eosin lẫn xanh metylen. Độ pH là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến chất lượng phiến đồ, bất kỳ sự thay đổi pH nào đều có thể dẫn đến tính chất bắt màu của các tế bào bị sai lệch, do đó, độ pH thích hợp được khuyến cáo là từ 6,5 - 6,8.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư, hóa chất

Vật tư, hóa chất nhuộm tự động

- Lamen , keo gắn lamen

- Lam kính có chất chống bong

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Dung dịch tẩy nến

- Dung dịch dầu khoáng

- Dung dịch rửa

- Bộ kít nhuộm May – Grunwald – Giemsa

- Cồn 70°, 80°, 95°, 100°

- Xylen hoặc Toluen

Vật tư, hóa chất nhuộm tay

- Lamen , keo gắn lamen

- Lam kính sạch.

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Cồn 70°, 80° , 95°, 100°

- Xylen hoặc Toluen

- Dung dịch May-Grünwald mẹ (giữ được 2 tuần):

+ Eosin - xanh metylen 1g

+ Cồn tuyệt đối (metanol) 100ml

- Dung dịch khi nhuộm:

+ May - Grünwald mẹ: 40ml

+ Cồn metanol tuyệt đối: 20ml

- Pha dung dịch Giemsa:

+ Giemsa mẹ: 10ml

+ Nước cất: 90ml

2.3. Trang thiết bị

- Máy cắt lát mỏng

- Kính hiển vi quang học

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Máy nhuộm đặc biệt

- Máy đo pH

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm là mẫu mô đã vùi paraffin

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 2 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn Phòng xét nghiệm

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

Nhuộm tự động:

- Bước 1: Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

- Bước 2: Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

- Bước 3: Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

- Bước 4: Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

Nhuộm tay:

- Bước 1: Tiêu bản tẩy paraffin bằng xylen và cồn

- Bước 2: Rửa nước

- Bước 3: Dung dịch May - Grünwald: 5 phút

- Bước 4 Nước chảy: 1 phút

- Bước 5: Dung dịch Giemsa: 10 -20 phút

- Bước 6: Để khô tự nhiên

- Bước 7: Gắn bôm

Kết quả:

Bác sĩ giải phẫu bệnh phân tích kết quả nhuộm trên kính hiển vi quang học:

- Các thành phần có tính acid của tế bào bắt màu xanh (xanh metylen).

- Các thành phần kiềm của tế bào bắt màu đỏ da cam.

- Hồng cầu: màu hồng tím đến trung bình, không có màu xám hoặc màu xanh.

- Bạch cầu đa nhân trung tính màu xanh đậm, nhân tím hay đỏ tím hoa cà, bào tương màu hồng nhạt.

- Bạch cầu ái toan: màu xanh đến màu xanh đậm với nhân màu tím, bào tương màu xanh

- Bạch cầu ái kiềm: có thể bắt màu tím đến xanh đậm, nhân màu đen.

- Lymphô bào và bạch cầu đơn nhân: màu tím đậm, bào tương màu xanh da trời.

- Tiểu cầu: màu tím.

- Các tế bào biểu mô: nhân màu xanh, bào tương hồng hay phớt hồng.

- Các vi khuẩn: màu xanh.

4.2. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định tại cơ sở

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

- Tiêu bản bị đen: cắt dày quá

- Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.

- Tuân thủ đúng độ pH của phẩm nhuộm từ 6,5 - 6,8. Nếu độ pH kiềm quá hay acid quá đều gây sai lạc tính chất bắt màu của các tế bào. Bởi vậy, cần kiểm tra độ pH trước khi nhuộm. Nếu độ pH thấp, cần điều chỉnh bằng dung dịch đệm có pH 7,2.

- Cần tuân thủ thời gian nhuộm, nếu thời gian nhuộm ngắn hoặc quá dài đều ảnh hưởng đến chất lượng chẩn đoán. Nếu sử dụng Giemsa R (nhanh), thời gian nhuộm khoảng 10 phút.

- Phiến đồ nếu dàn không đều sẽ làm ảnh hưởng đến kết quả nhuộm ở những vùng tế bào chồng chất nhau, do vậy, phiến đồ cần dàn mỏng, đều trước khi nhuộm.

- Cồn dùng để vệ sinh tay có thể gây tan hồng cầu.

- Không để phiến đồ bị khô ở bất kỳ bước nhuộm nào.

- Rửa phiến đồ không đúng cách sẽ gây ra các dấu hiệu giả (artifacts), do đó cần rửa phiến đồ dưới vòi nước chảy.

- Độ pH của nước rửa có thể ảnh hưởng mạnh tới tính chất bắt màu của các tế bào. Nếu độ pH kiềm quá, sẽ làm tăng màu xanh và nếu độ pH acid, sẽ làm tăng màu hồng đỏ của các tế bào khi nhuộm.

- Phẩm nhuộm May-Grünwald - Giemsa rất dễ cháy và độc với da, đường hô hấp, đường tiêu hóa (nếu chẳng may nuốt phải). Bởi vậy, phải đóng kín miệng lọ phẩm nhuộm, tránh xa lửa, không hút thuốc trong khi nhuộm. Khi tiến hành nhuộm, cần có khẩu trang, găng tay bảo hộ. Nếu chẳng may khi tiếp xúc, cảm thấy nguy hiểm cần khám và tư vấn bác sĩ.

- Không sử dụng phẩm nhuộm khi đã hết hạn sử dụng, do vậy, cần kiểm tra hạn dùng của phẩm nhuộm trước khi tiến hành nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

2. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

32. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM SOUDAN III HOẶC IV

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả và hướng dẫn quy trình, cách thực hiện và chẩn đoán kỹ thuật nhuộm Soudan III hoặc IV trong dung dịch Ethanol

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Nhận dạng các lipid kỵ nước ở trạng thái lỏng theo cơ chế vật lý vật chuyển một thể có màu (lysochrom) từ dung môi hoà tan (cồn, diacetin, propylen, ethylen glycol,v.v…) vào trong lipid ở trạng thái lỏng

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ : 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư, hóa chất

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Lam kính sạch

- Lamen

- Giấy thấm, gạc sạch

- Bút chì để ghi tên tuổi bệnh nhân

- Chổi lông mềm

- Phẩm nhuộm Soudan III hoặc IV trong Ethanol

Soudan III hoặc IV: 1g

Etanol 70%: 50ml

Aceton: 50ml

Bảo quản trong lọ nút kín, lọc trước khi sử dụng

- Gel cắt lạnh

- Cồn tuyệt đối

- Gắn lá kính: Glycerogel hoặc siro Apathy

2.3. Trang thiết bị

- Máy cắt lạnh ở trạng thái sẵn sàng hoạt động

- Dụng cụ phẫu tích bệnh phẩm

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Kính hiển vi quang học

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Bệnh phẩm sau khi lấy ra khỏi cơ thể phải gửi ngay đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh (không cố định)

- Kỹ thuật viên tiếp nhận, ghi thông tin.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 2 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn Phòng xét nghiệm

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Bước 1: Làm lạnh mẫu bệnh phẩm và cắt mảnh

- Đặt mẫu bệnh phẩm vào gá đúc lạnh rồi đưa ngay vào vị trí tương ứng trên thanh làm lạnh trong buồng lạnh của máy, phủ gel cắt lạnh, chờ cho đến khi khối bệnh phẩm đông cứng.

- Mẫu mô sau khi đông cứng được cắt lát mỏng dày 10-15µm

- Cố định mảnh mô (để giữ nguyên hình dáng và bắt màu thuốc nhuộm): cố định bằng cồn tuyệt đối

Bước 2: Tiến hành nhuộm

- Mảnh cắt rửa trong nước cất

- Ngâm mảnh cắt vào ethanol 70% vài giây.

- Ngâm vào trong dung dịch bão hoà Soudan trong cồn 70% trong 5 phút (có thể dùng dung dịch Herxheimer).

- Ngâm nhiều lần trong ethanol 70% cho đến khi không còn vết của phẩm nhuộm thôi ra nữa.

- Rửa nước cất.

- Nhuộm nhân bằng Hemalun hoặc xanh lơ toluidin 0,5%.

- Rửa nước cất.

- Gắn glyxerogel hoặc sirô Apathy

4.4. Diễn giải và báo cáo

Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh...

4.2. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ bằng File mềm và sổ sách tại Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh thực hiện

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

- Mảnh cắt bị co lại: nhiệt độ máy cắt lạnh không đủ lạnh, để lâu hơn hoặc sử dụng bình xịt làm lành nhanh

- Thời gian nhuộm điều chỉnh sao cho phù hợp

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

2. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

3. Freida Carson: Histotechnoloy, 3rd editon, 2017.

33. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM OIL RED O TRONG DUNG DỊCH ETHANOL

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Oil red O để phát hiện chất béo.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Oil red O là một thuốc nhuộm nhóm Diazo có khả năng hoà tan cao trong chất béo. Oil red O được hoà tan trong dung dịch cồn khi tiếp xúc với mô giàu chất béo, thuốc nhuộm này rời khỏi dung môi và di chuyển đến mô mỡ. Kỹ thuật nhuộm này thực hiện trên bệnh phẩm tươi do chất béo sẽ bị mất đi trong quá trình xử lý mô thông thường. Kỹ thuật nhuộm Oil red O cho phép nhuộm cả nhân của tế bào tổn thương, nên rất có lợi cho việc nhận định cấu trúc mô học.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư, hóa chất

2.2.1. Vật tư

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Lamen, lam kính

- Giấy thấm, gạc sạch

- Bút chì để ghi tên tuổi bệnh nhân

- Chổi lông mềm

2.2.2 Hóa chất

- Dung dịch Oil red O -Isopropyl.

Oil red O: 0.5g

Cồn isopropyl tuyệt đối 100ml

Để dung dịch này qua đêm

- Dung dịch Dextrin

Dextrin: 1g

Nước cất: 100ml

- Hóa chất nhuộm:

Dung dịch Oil red O -Isopropyl: 60ml

Dextrin: 40ml

- Dung dịch gắn Lamen thích hợp.

2.3. Trang thiết bị

- Máy cắt lạnh

- Dụng cụ phẫu tích bệnh phẩm

- Các bể nhuộm, giá nhuộm

- Máy hút ẩm

- Tủ hút

- Kính hiển vi quang học

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Bệnh phẩm sau khi lấy ra khỏi cơ thể phải gửi ngay đến phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh (không cố định)

- Kỹ thuật viên tiếp nhận, ghi thông tin.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 1,5 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1 Các bước thực hiện

4.1.1 Phẫu tích bệnh phẩm

- Bác sĩ quan sát, mô tả một số đặc điểm của bệnh phẩm (số lượng, kích thước, tính chất...), xác định vùng tổn thương cần lấy mẫu cắt lạnh.

4.1.2 Làm lạnh mẫu bệnh phẩm và cắt mảnh

- Đặt mẫu bệnh phẩm vào giá đúc lạnh rồi đưa ngay vào vị trí tương ứng trên thanh làm lạnh trong buồng lạnh của máy, phủ gel cắt lạnh, chờ cho đến khi khối bệnh phẩm đông cứng.

- Mẫu mô sau khi đông cứng được lấy mặt phẳng bởi các lát cắt 10-15µm, sau đó điều chỉnh độ dày về 2-5micromet.

- Kết hợp với chổi lông mềm dàn mảnh mô lên phiến kính.

- Cố định mảnh mô: để khô ở nhiệt độ phòng

4.1.3 Nhuộm mảnh cắt

- Đặt các mảnh cắt lạnh trực tiếp vào dung dịch Oil red O -Isopropyl trong 20 phút.

- Rửa tiêu bản trong nước chảy.

- Nhuộm đối màu bằng Gill II Hematoxylin x 30 giây

- Rửa tiêu bản trong nước chảy

- Gắn lamen bằng dung dịch gắn.

Kết quả:

+ Chất béo: đỏ

+ Nhân: xanh

4.2. Nhận định kết quả

Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh giá trên kính hiển vi quang học.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ theo quy định tại cơ sở.

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

- Mảnh cắt bị co lại: nhiệt độ máy cắt lạnh không đủ lạnh, để lâu hơn hoặc sử dụng bình xịt làm lành nhanh

- Màu sắc nhân và chất béo quá đậm hoặc quá nhạt: Điều chỉnh thời gian nhuộm sao cho phù hợp.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

34. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ĐEN SOUDAN B TRONG DIACETIN

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm đen Soudan B trong Diacetin

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Nhận dạng các lipid kỵ nước ở trạng thái lỏng theo cơ chế vật lý vật chuyển một thể có màu (lysochrom) từ dung môi hoà tan (cồn, diacetin, propylen, etylen glycol, v.v…) vào trong lipid ở trạng thái lỏng

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư, hóa chất

2.2.1. Vật tư

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Chổi lông mềm

- Lam kính sạch, lamen

- Bút chì (để ghi tên tuổi bệnh nhân)

- Giấy thấm, gạc sạch

- Gel cắt lạnh

- Găng tay, khẩu trang, mũ

2.2.2 Hóa chất

- Cồn tuyệt đối

- Phẩm nhuộm Đen Soudan B trong diacetin, Kernechtrol

- Dung dịch gắn lamen.

2.3. Trang thiết bị

- Máy cắt lạnh.

- Dụng cụ phẫu tích bệnh phẩm

- Các bể nhuộm, giá nhuộm

- Máy hút ẩm

- Tủ hút

- Kính hiển vi quang học

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Bệnh phẩm sau khi lấy ra khỏi cơ thể phải gửi ngay đến phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh (không cố định)

- Kỹ thuật viên tiếp nhận, ghi thông tin

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 2 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1 Các bước thực hiện

4.1.1 Phẫu tích bệnh phẩm

- Bác sĩ quan sát, mô tả một số đặc điểm của bệnh phẩm (số lượng, kích thước, tính chất...), xác định vùng tổn thương cần lấy mẫu cắt lạnh.

4.1.2 Làm lạnh mẫu bệnh phẩm và cắt mảnh

- Đặt mẫu bệnh phẩm vào giá đúc lạnh rồi đưa ngay vào vị trí tương ứng trên thanh làm lạnh trong buồng lạnh của máy, phủ gel cắt lạnh, chờ cho đến khi khối bệnh phẩm đông cứng.

- Mẫu mô sau khi đông cứng được lấy mặt phẳng bởi các lát cắt 10-15µm, sau đó điều chỉnh độ dày về 2-5micromet.

- Kết hợp với chổi lông mềm dàn mảnh mô lên phiến kính.

- Cố định mảnh mô: để khô ở nhiệt độ phòng

4.1.3 Nhuộm mảnh cắt

- Chuyển các mảnh cắt lạnh vào dung dịch nước 50% diacetin, trong 30 giây và lắc đều.

- Nhuộm trong dung dịch Đen Soudan B vừa mới lọc trong một giờ.

- Biệt hoá nhanh (30 giây) trong dung dịch nước 50% diacetin.

- Rửa nước cất.

- Nhuộm nhân bằng Kernechtrol.

- Rửa nước cất.

- Gắn trong glycerogel hoặc sirô Apathy.

Kết quả:

+ Lipid ở trạng thái lỏng (triglycerit không bão hoà, cholesterit không bão hoà, acid béo không bão hoà, glycolipid và photpholipid) bắt màu đen.

4.2. Nhận định kết quả

Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh giá trên kính hiển vi quang học: Lipid ở trạng thái lỏng (triglycerit không bão hoà, cholesterit không bão hoà, acid béo không bão hoà, glycolipid và photpholipid) bắt màu đen.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định tại cơ sở.

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

- Mảnh cắt bị co lại: nhiệt độ máy cắt lạnh không đủ lạnh, để lâu hơn hoặc sử dụng bình xịt làm lành nhanh

- Thời gian nhuộm điều chỉnh sao cho phù hợp

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

35. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GROCOTT

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Grocott

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Kỹ thuật này dùng để phát hiện nấm, pneumocystis carinii dựa theo nguyên lý kỹ thuật Gomori trong bạc – methenamine. Nguyên lý chung của phản ứng gần giống với nguyên lý trong phản ứng PAS: nhóm các chất phản ứng bị oxy hóa bằng acid chromic hoặc permanganate sẽ tạo ra các aldehyd và người ta có thể phát hiện ra các aldehyd này nhờ vào hiện tượng thủy phân phức chất bạc - methenamine.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư, hóa chất

2.2.1. Vật tư

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Lamen , pipet 1 lần

- Lam kính

2.2.2 Hóa chất

* Hoá chất dùng để cho nhuộm thủ công:

- Dung dịch tẩy nến ( Xylen hay toluen…)

- Cồn (70°, 80°, 95°, tuyệt đối)

- Dung dịch acid chromic 5%

- Dung dịch bisunfit Na 1%

- Dung dịch bạc – methenamin

- Dung dịch chlorua vàng

- Dung dịch hyposunfit Na 2%

- Dung dịch Vert lumière

- Dung dịch bạc – methenamin

- Keo gắn lamen

* Hoá chất dùng cho nhuộm máy

- Bộ kít nhuộm Grocott dành cho máy nhuộm tự động

2.3. Trang thiết bị

- Máy cắt lát mỏng

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Kính hiển vi quang học

- Bể nhuộm, giá nhuộm

- Máy hút ẩm

- Tủ an toàn sinh học.

- Máy nhuộm đặc biệt tự động

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm đã được vùi trong paraffin

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 2 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm .

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

* Đối với quy trình nhuộm thủ công

+ Các mảnh cắt được tẩy parafin qua 3 bể toluen (hoặc xylen), mỗi bể 2 phút

+ Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút

+ Rửa trong nước cất 3 - 5 phút

+ Oxy hóa trong dung dịch acid chromic 5% trong 1giờ

+ Rửa nước chảy 2 - 3 phút

+ Rửa trong dung dịch bisunfit Na 1% trong 1phút

+ Rửa qua nước chảy: 5 - 10 phút

+ Rửa trong 3 - 4 bể nước cất: mỗi bể 5 lần nhúng

+ Ngâm trong dung dịch bạc - methenamin ở nhiệt độ 58º khoảng 30 - 60 phút cho đến khi mảnh cắt có màu vàng nâu

+ Lấy mảnh cắt ra, ngâm trong nước cất. Kiểm tra màu sắc dưới kính hiển vi.

+ Rửa trong 6 bể nước liên tiếp, mỗi bể 5 lần nhúng.

+ Thúc trong dung dịch chlorua vàng trong 2 - 5 phút

+ Rửa trong nước cất

+ Loại bỏ bạc thừa bằng dung dịch hyposunfit Na 2% trong 2 - 5 phút

+ Rửa nước thật kỹ

+ Nhuộm nền bằng xanh lá cây sáng: 30 - 50 giây

+ Đẩy nước bằng cồn 95° và 100°

+ Làm trong bằng 3 bể toluen sạch

+ Gắn lamen bằng chất gắn

* Đối với quy trình nhuộm máy tự động

- Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm ( nếu sử dụng máy nhuộm tự động)

- Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

Kết quả:

Bác sĩ giải phẫu bệnh đánh giá kết quả trên kính hiển vi quang học:

+ Nấm: màu nâu đen - đen

+ Chất nền: xanh nhạt

+ Chất nhầy: màu ghi đậm.

4.2. Nhận định kết quả.

Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh giá trên kính hiển vi quang học.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

+ Khi nhuộm, cần có mảnh cắt chứng đã có thành phần nấm dương tính với phẩm nhuộm này. Nếu mảnh cắt âm tính giả, nên kiểm tra hạn dùng của dung dịch bạc – methenamin để thay dung dịch mới hoặc để thời gian nhuộm lâu hơn.

+ Trong bước 9 của quy trình nhuộm, dung dịch methenamin được chuẩn bị ngay trước khi sử dụng và cần hâm nóng đến 58°C bằng cách nhanh nhất, mảnh cắt sẽ được tráng màu nâu vàng bằng dung dịch bạc - methenamin và được kiểm tra mức độ bắt màu.

+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá.

+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

36. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM XANH PHỔ PERL PHÁT HIỆN ION SẮT

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Xanh Perl

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Phản ứng Perl là một trong phản ứng hóa mô kinh điển đầu tiên. Mảnh mô được xử lý bằng dung dịch acid ferrocyanit sẽ bộc lộ ion sắt dưới dạng hydroxide [Fe(OH)3] bằng cách hòa tan acid hydrochloric. Sau đó, ion sắt phản ứng với dung dịch ferrocyanide kali để tạo ra phức màu xanh không hòa tan là ferrocyanide sắt (màu xanh phổ)

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư, hóa chất

2.2.1. Vật tư

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Lamen , pipet 1 lần

- Lam kính

2.2.2. Hóa chất

* Hoá chất dùng để cho nhuộm thủ công:

- Dung dịch tẩy nến ( Xylen hay toluen…)

- Cồn (70°, 80°, 95°, tuyệt đối)

- 1% dung dịch nước ferrocyanid kali

- 2% dung dịch nước acid hydrochloric

- dung dịch (fast red) 0,1%.

- Nước cất

- Keo gắn lamen

* Hoá chất dùng cho nhuộm máy

- Bộ kít nhuộm Grocott dành cho máy nhuộm tự động

2.3. Trang thiết bị

- Máy cắt lát mỏng

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Kính hiển vi quang học

- Bể nhuộm, giá nhuộm

- Máy hút ẩm

- Tủ an toàn sinh học.

- Máy nhuộm đặc biệt tự động

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm đã được trong vùi paraffin

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 2 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Tiến hành kỹ thuật

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

* Đối với quy trình nhuộm thủ công

+ Tẩy parafin mảnh cắt bằng 3 bể toluen (hoặc xylen), mỗi bể 2 phút

+ Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút

+ Rửa trong nước cất 3 - 5 phút

+ Xử lý mảnh cắt bằng dung dịch acid ferrocyanid mới pha x 30 phút

+ Rửa kỹ trong nước cất

+ Nhuộm nhạt nhân bằng dung dịch đỏ trung tính 0,5% hoặc đỏ nhanh (fast red) 0,1%.

+ Rửa nhanh trong nước cất.

+ Đẩy nước bằng cồn 95° và 100°.

+ Làm trong bằng 3 bể toluen sạch, Gắn lamen

* Đối với quy trình nhuộm máy tự động

+ Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

+ Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

+ Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

4.2. Nhận định kết quả

Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh giá trên kính hiển vi quang học:

+ Ion sắt: xanh

+ Nhân: đỏ

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

+ Nên chuẩn bị dung dịch nhuộm ngay trước khi sử dụng do dung dịch acid hydrochloric mới pha sẽ có tác dụng hiệu quả hơn để tách liên kết protein với ion sắt, đồng thời, nên có mảnh cắt chứng nhuộm với nước.

+ Trong bước 7, nếu sử dụng vòi nước chảy để rửa sẽ làm cho nền tiêu bản có màu đỏ và sẽ mất độ tương phản của nhân tế bào.

Bước 9 có tác dụng biệt hóa màu đỏ khi khử nước.

+ Nên tránh các chất cố định có acid hoặc dichromate hoặc các dung dịch acid dùng để khử calci. Các chất phản ứng như vậy có thể làm mất khả năng thủy phân ion sắt của mô, tạo ra kết quả âm tính giả.

+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá

+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

37. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM BẠC WARTHIN – STARY PHÁT HIỆN HELICOBACTER PYLORI

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm bạc Warthin - Stary

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Kỹ thuật này dùng để phát hiện xoắn khuẩn và Helicobacter pylori cùng một số loại vi khuẩn khác. Cơ sở của kỹ thuật là dựa vào khả năng của một số vi khuẩn có thể gắn với ion bạc có trong dung dịch. Sau bước gắn ion bạc, mảnh mô được tiếp xúc với chất khử hydroquinon, nhờ đó, các ion bạc đã gắn với mô và vi khuẩn có thể chuyển ngược trở thành bạc kim loại nhìn thấy được. Trước khi nhuộm, mảnh mô được xử lý làm tăng tính mẫn cảm với phức hợp bạc. Dung dịch nước của bạc nitrat có gia thêm chất khử hydroquinon để giúp tạo ra phức hợp diamin bạc.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư, hóa chất

2.2.1. Vật tư

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Lamen , pipet 1 lần

- Lam kính

2.2.2. Hóa chất

* Hoá chất dùng để cho nhuộm thủ công :

- Dung dịch tẩy nến ( xylen hay toluen…)

- Cồn (70°, 80°, 95°, tuyệt đối)

- Dung dịch acid acetic 1,2%

- Dung dịch bạc nitrat 6%

* Hoá chất dùng nhuộm máy:

- Dung dịch tẩy nến ( xylen hoặc toluen..)

- Dung dịch rửa

- Bộ kít nhuộm - Bộ kít nhuộm Warthin - Stary

2.3. Trang thiết bị

- Máy cắt lát mỏng

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Kính hiển vi quang học

- Bể nhuộm, giá nhuộm

- Máy hút ẩm

- Tủ an toàn sinh học.

- Máy nhuộm đặc biệt tự động

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm đã được trong vùi paraffin

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 2 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

* Đối với quy trình nhuộm thủ công:

+ Tẩy parafin mảnh cắt bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút

+ Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút

+ Rửa nước

+ Nhấn chìm mảnh cắt trong bể nước đã làm mất ion (bể đựng nước này phải rửa sạch).

+ Ủ trong bạc nitrat 1% (AgNO3) x 30 – 60 phút ở nhiệt độ 45 - 60°C.

+ Chuẩn bị thuốc hiện hình (developer).

+ Ủ trong thuốc hiện hình 1 phút ở 56°C.

+ Soi kiểm tra sự bắt màu trên kính hiển vi.

+ Rửa dưới vòi nước ấm để ngừng phản ứng.

+ Rửa bằng nước cất nóng ở 56°C.

+ Rửa bằng nước cất lạnh.

+ Ủ trong sodium thiosunfat 2 – 5% x 1 phút.

+ Rửa bằng nước cất.

+ Làm mất nước nhanh bằng cồn 95º và cồn tuyệt đối

+ Làm trong bằng 3 bể toluen sạch ,gắn lamen bằng bôm Canada

* Đối với quy trình nhuộm máy

+ Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

+ Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

+ Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

4.2. Nhận định kết quả

Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh giá trên kính hiển vi quang học:

+ Vi khuẩn: đen

+ Mô nền: vàng tươi

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

+ Cần thay đổi thời gian tráng khác nhau tùy mảnh cắt để có thể đạt kết quả tối đa.

+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá

+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

38. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM SẮT CAO

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Diamine sắt cao

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Kỹ thuật diamin sắt cao được coi là kỹ thuật chuẩn để phát hiện các chất nhày có nhóm sunfat. Nguyên lý của phương pháp: một hỗn hợp các muối diamin được oxy hoá bằng clorua sắt hình thành một chất màu đen, liên kết với các nhóm sunfat este. Bằng cách nhuộm tương phản với xanh alcian (mà chỉ nhuộm các chất nhày carboxyl hoá), đã phân biệt được rõ về màu sắc giữa 2 nhóm chính của chất nhày acid. Một điều đáng chú ý, đó là các chất nhày sunfat của các tuyến phế quản dường như không phản ứng với hỗn hợp diamin clorua sắt..

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y : 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư, hóa chất

2.2.1. Vật tư

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Lamen , pipet 1 lần

- Lam kính

2.2.2 Hóa chất

* Hoá chất dùng để cho nhuộm thủ công :

- Dung dịch tẩy nến ( Xylen hay toluen…)

- Cồn (70°, 80°, 95°, tuyệt đối)

- Sodium photphat monobasic

- Sodium photphat dibasic (khan: anhydrous)

- Xanh alcian

- Acid acetic

- Đỏ trung tính.

- N,N - dimethyl - meta - phenylenediamin - dihydrochlorit.

- N,N - dimethyl - para - phenylenediamine- dihydrochlorit.

- Clorua sắt

- Nước cất 2 lần.

* Hoá chất dùng để nhuộm máy

- Bộ kít nhuộm Diamine sắt cao

2.3. Trang thiết bị

- Máy cắt lát mỏng

- Tủ ấm

- Tủ hút

- KHV quang học

- Bể nhuộm, giá nhuộm

- Máy hút ẩm

- Tủ an toàn sinh học.

- Máy nhuộm đặc biệt tự động

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm đã được trong vùi paraffin

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 2 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh.

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

* Đối với quy trình nhuộm thủ công

- Để khô mảnh cắt ở tủ 37°C, 12 giờ trước khi nhuộm.

- Các mảnh cắt làm chứng và các mảnh cắt cần nhuộm được tẩy parafin, qua cồn, rửa nước và rửa nước cất.

- Nhúng các mảnh cắt trong dung dịch diamin 18-24 giờ.

- Rửa kỹ trong nước chảy.

- Nhuộm tương phản (nếu cần thiết) bằng xanh alcian 1% trong acid acetic 3% trong 5 phút.

- Nhuộm nhân bằng đỏ trung tính 0,5% trong 2-3 phút.

- Rửa qua nước.

- Tẩy nước bằng cồn tuyệt đối.

- Làm trong bằng xylen và gắn lamen bằng bôm Canada.

* Đối với quy trình nhuộm máy

- Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

- Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

4.2. Nhận định kết quả

Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh giá trên kính hiển vi quang học:

- Sulfat mucin : đen-nâu

- Carboxylate mucin : xanh

- Nhân : đỏ.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá

+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

39. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GOMORI CHO SỢI VÕNG

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Gomori cho sợi võng

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Dựa vào tính ưa bạc của sợi võng, người ta đã sử dụng phương pháp nhuộm tẩm/ngấm bạc để phát hiện loại sợi đặc biệt này. Hai phương pháp nhuộm sợi võng thông dụng nhất là Gomori và Gordon – Sweet. Bước đầu tiên của quy trình là thực hiện oxy hóa chất đường hexose có trong sợi võng để tạo ra aldehit. Bước tiếp theo làm “tăng độ nhạy” do lắng đọng thành phần kim loại (ammonium sunfat) quanh sợi võng. Hiện tượng tẩm/ngấm bạc xảy ra khi dung dịch bạc diamin hoặc bạc ammoniac bị oxy hóa tạo ra aldehit. Oxy hóa tiếp theo của bạc diamin khi mảnh cắt được chuyển vào trong formaldehit. Bước này được gọi là “tráng bạc”. Sau cùng, kim loại vàng có trong clorua vàng đã thay thế kim loại bạc để làm tăng độ “sắc nét” sợi võng, làm chúng chuyển từ màu nâu sang màu đen.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y : 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư, hóa chất

2.2.1. Vật tư

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Lamen , pipet 1 lần

- Lam kính

2.2.2 Hóa chất

* Hoá chất dùng cho nhuộm thủ công:

- Dung dịch tẩy nến ( xylen hoặc toluen…)

- Cồn 70°, 80°, 95°, cồn tuyệt đối

- Formalin 4%

- Dung dịch permanganat kali 1%

- Dung dịch metabisunfat kali 2%

- Dung dịch phèn sắt (iron alum) 2%

- Dung dịch bạc

- Dung dịch clorua vàng 0,2%

- Dung dịch metabisunfat kali 2%

- Dung dịch sodium thiosunfat 2%

- Phẩm nhuộm van Gieson hoặc eosin

* Hoá chất dùng cho nhuộm máy:

- Bộ kít nhuộm Gomori

2.3. Trang thiết bị

- Máy cắt lát mỏng

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Kính hiển vi quang học

- Khay, giá, cốc đựng phẩm nhuộm

- Máy nhuộm đặc biệt.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm đã được trong vùi paraffin

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 2 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm .

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

* Đối với quy trình nhuộm thủ công:

+ Tẩy parafin các mảnh cắt bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút.

+ Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút.

+ Rửa trong nước cất 3 – 5 phút.

+ Xử lý bằng dung dịch permanganat kali 1% x 2 phút.

+ Rửa dưới vòi nước chảy.

+ Làm trắng trong dung dịch metabisunfat kali 2% .

+ Rửa dưới vòi nước chảy.

+ Xử lý bằng dung dịch phèn sắt (iron alum) 2% x 2 phút.

+ Rửa vài lần bằng nước cất.

+ Đặt mảnh cắt vào trong bình Coplin đựng dung dịch bạc x 1 phút.

+ Rửa vài lần bằng nước cất.

+ Khử bằng dung dịch nước formalin 4% x 3 phút.

+ Rửa dưới vòi nước chảy.

+ Làm sắc nét bằng dung dịch clorua vàng 0,2% x 10 phút.

+ Rửa dưới vòi nước chảy.

+ Xử lý bằng dung dịch metabisunfat kali 2% x 1 phút.

+ Rửa dưới vòi nước chảy.

+ Xử lý bằng dung dịch sodium thiosunfat 2% x 1 phút.

+ Rửa dưới vòi nước chảy.

+ Nhuộm đối màu bằng van Gieson hoặc eosin.

+ Đẩy nước bằng cồn 95° và 100°

+ Làm trong bằng 3 bể toluen sạch

+ Gắn lamen

* Đối với quy trình nhuộm máy

+ Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

+ Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

+ Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

4.2. Nhận định kết quả

Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh giá trên kính hiển vi quang học: Sợi võng: đen xám nhạt

Nhân: xanh đen

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá

+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

40. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ORCEIN CẢI BIÊN THEO SHIKATA PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN HbsAg

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Orcein cải biên theo Shikata

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Kháng nguyên virus viêm gan B gồm 2 thành phần là kháng nguyên lõi (HBcAg) có bản chất DNA và kháng nguyên bề mặt (HBsAg) có bản chất lipoprotein. Thông thường, orcein sẽ nhuộm cầu nối disunfit có trong thành phần xistin của HBsAg; nhờ vậy, người ta có thể phát hiện được sự có mặt của virus trong tế bào gan.

Kỹ thuật orcein cải biên theo Shikata có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn một số kỹ thuật orcein thông thường, đồng thời giá thành rẻ, dễ thực hiện và lợi thế của kỹ thuật là có thể thực hiện được kể cả khi mô gan đã được vùi parafin, thậm chí đã lưu trữ rất lâu, mặc dù hiện nay, cơ chế của hiện tượng nhuộm vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y : 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư, hóa chất

2.2.1. Vật tư

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Lamen , pipet 1 lần

- Lam kính

2.2.2 Hóa chất

* Dùng cho quy trình nhuộm thủ công:

- Dung dịch tẩy nến ( xylen hoặc toluen)

- Cồn 70°,80°, 95°, tuyệt đối

- Dung dịch nước permanganat kali 0,5%

- Acid sunfuric đậm đặc

- Orcein

- Cồn etylic 70%

- HCl đậm đặc

- Dung dịch gắn lamen

* Dùng cho quy trình nhuộm máy :

- Bộ kít nhuộm Orcein theo Shikata

2.3. Trang thiết bị

- Máy cắt lát mỏng

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Kính hiển vi quang học

- Khay, giá, bể đựng phẩm nhuộm

- Máy nhuộm đặc biệt

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm đã được trong vùi paraffin

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 2 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

(*) Đối với quy trình nhuộm thủ công:

+ Tẩy parafin các mảnh cắt bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút.

+ Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút.

+ Rửa nước.

+ Oxy hóa trong dung dịch (A): 5 phút.

+ Rửa nước

+ Làm mất màu trong oxalic acid 2%

+ Rửa bằng nước cất, sau đó rửa nước chảy 3 phút

+ Nhuộm màu bằng dung dịch orcein (B): 2 - 4 giờ

+ Rửa nước

+ Biệt hóa trong dung dịch cồn 70% - HCl.

+ Làm mất nước nhanh bằng cồn 95º và cồn tuyệt đối.

+ Làm trong bằng 3 bể toluen sạch.

+ Gắn lamen bằng dung dịch gắn.

* Đối với quy trình nhuộm máy

+ Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

+ Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

+ Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

4.2. Nhận định kết quả

Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh giá trên kính hiển vi quang học: Bào tương tế bào gan nhiễm virus viêm gan B: dạng thủy tinh mờ.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá

+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

41. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ORCEIN PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN VIÊM GAN B (HbsAg) TRONG MÔ GAN

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Orcein.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Thông thường, virus có kích thước rất nhỏ và chỉ có thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử. Virus chỉ được coi là vật ký sinh khi chúng sinh sản (được nhân lên) trong tế bào vật chủ. Các tiểu phần virus nằm bên trong tế bào vật chủ được gọi là “thể vùi virus” và có thể thấy bằng kính hiển vi quang học. HBsAg (kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B) thường xuất hiện dưới dạng thể vùi trong bào tương tế bào gan. Bào tương của tế bào Küpffer cũng có thể có kháng nguyên này. Phẩm nhuộm orcein và andehit - fuscin có khả năng nhuộm cầu nối disunfit có trong thành phần cistin của HBsAg và tạo ra hình ảnh “thủy tinh mờ” của tế bào gan bị nhiễm virus.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y: 01

- Hộ lý : 01

2.2. Vật tư, hóa chất

2.2.1. Vật tư

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Lamen , keo gắn lamen

- Lam kính sạch.

2.2.2 Hóa chất

(*) Đối với quy trình nhuộm thủ công

- Dung dịch tẩy nến ( xylen hoặc toluen)

- cồn 100°, 95°, 80°, cồn-acid 1%

- permanganat kali

- acid oxalic

- Acid periodic 5%

- phẩm nhuộm orcein

(*) Đối với quy trình nhuộm máy:

- Bộ kít nhuộm Orcein

2.3. Trang thiết bị

- Máy cắt lát mỏng

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Kính hiển vi quang học

- Máy nhuộm đặc biệt.

- Khay, giá, bể đựng phẩm nhuộm

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm đã được trong vùi paraffin

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

- Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển đến Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh – tế bào học, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 2 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm .

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

(*) Đối với quy trình nhuộm thủ công :

+ Tẩy parafin bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút

+ Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút

+ Rửa nước

+ Oxy hóa trong permanganat kali (5 - 10 phút)

+ Rửa nước

+ Tẩy trắng trong acid oxalic (nhìn cho tới trắng)

+ Rửa nước chảy, rồi rửa lại bằng nước cất

+ Acid periodic 5% trong 5 phút

+ Rửa nước chảy, rồi rửa lại bằng nước cất

+ Nhuộm orcein trong lò vi sóng ở công suất thấp trong 30 - 45 giây, rồi tiếp tục để như vậy trong 30 phút. Kiểm tra dưới kính hiển vi, có thể nhuộm lại nếu chưa đủ màu đen.

+ Rửa trong cồn 70°.

+ Biệt hóa trong cồn-acid 1% cho tới khi không còn phẩm màu chảy ra từ mảnh cắt.

+ Rửa bằng cồn 70°.

+ Làm mất nước nhanh bằng cồn 95º và cồn tuyệt đối

+ Làm trong bằng 3 bể toluen sạch

+ Gắn lamen bằng dung dịch gắn

(*) Đối với quy trình nhuộm máy:

+ Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

+ Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

+ Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

4.2. Nhận định kết quả.

Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh giá trên kính hiển vi quang học:

+ Kháng nguyên HBsAg, sợi chun: đỏ tía

+ Các protein liên kết với đồng : đỏ tía sẫm

+ Nền: đỏ tía ánh nâu nhạt

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá

+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

42. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MUCICARMIN

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Mucicarmin .

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Phương pháp nhuộm nhằm phát hiện chất nhầy từ biểu mô

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y: 01

- Hộ lý : 01

2.2. Vật tư, hóa chất

2.2.1. Vật tư

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Lamen.

- Lam kính sạch.

2.2.2 Hóa chất

(*) Đối với quy trình nhuộm thủ công

- Dung dịch tẩy nến ( xylen hoặc toluen)

- cồn 100°, 95°, 80°

- dung dịch mucicarmin

- nước cất

(*) Đối với quy trình nhuộm máy

- Bộ kít nhuộm Murcamine

2.3. Trang thiết bị

- Máy cắt lát mỏng

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Kính hiển vi quang học

- Giá, khay, bể đựng phẩm nhuộm

- Máy nhuộm đặc biệt

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm đã được trong vùi paraffin

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

+ Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm.

+ Có ghi đầy đủ chẩn đoán lâm sàng, bao gồm các triệu chứng lâm sàng, các kết quả cận lâm sàng khác, phương pháp lấy bệnh phẩm, vị trí, số lượng bệnh phẩm.

+ Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

+ Ghi ngày giờ lấy bệnh phẩm, ngày giờ chuyển phòng xét nghiêm Giải phẫu bệnh, có hay không có cố định bệnh phẩm sơ bộ, loại dung dịch cố định.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật: 2 giờ

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật: Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

(*) Đối với quy trình nhuộm thủ công

+ Loại parafin như thường lệ.

+ Nhuộm mảnh cắt trong dung dịch mucicarmin pha loãng từ 10-15 phút hay lâu hơn.

+ Rửa nhanh trong nước cất.

+ Loại nước bằng cồn 80°, 95°, sau đó là cồn tuyệt đối.

+ Làm trong bằng xylen.

+ Gắn lamen bằng bôm Canada.

(*) Đối với quy trình nhuộm máy:

+ Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

+ Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

+ Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

4.2. Nhận định kết quả

Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh giá trên kính hiển vi quang học: Chất nhầy màu đỏ.

4.3 Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá

+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

43. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MAY – GRUNWALD – GIEMSA

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả và hướng dẫn quy trình, cách thực hiện nhuộm May – Grunwald – Giemsa cho tủy xương.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Phương pháp nhuộm này áp dụng cho tất cả các phiến đồ Tế bào học chọc hút kim nhỏ, tế bào bong và phiến đồ máu. Đây là sự kết hợp giữa hai phương pháp nhuộm Giemsa và May-Grünwald. Hỗn hợp thuốc nhuộm Giemsa và May-Grünwald là sự kết hợp của hỗn hợp có tính acid và kiềm của eosin lẫn xanh metylen. Độ pH là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến chất lượng phiến đồ, bất kỳ sự thay đổi pH nào đều có thể dẫn đến tính chất bắt màu của các tế bào bị sai lệch, do đó, độ pH thích hợp được khuyến cáo là từ 6,5 - 6,8.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư:

- Găng tay vô trùng, khẩu trang.

- Ống hút tự động.

- Lọ đựng dịch ly tâm

- Lam kính sạch, một đầu mài mờ.

- Bút chì mềm ghi mã số người bệnh, vị trí chọc hút

2.3. Hoá chất

- Cồn methanol

- Xylen (toluen)

- Dung dịch May – Grunwald

- Dung dịch Giemsa

- Glycerin

- Keo gắn

2.4. Trang thiết bị:

- Máy ly tâm

- Giá để đựng phiến kính đã dàn bệnh phẩm.

- Các dụng cụ để nhuộm: khay, giá, cốc pha thuốc nhuộm, ống hút.

- Kính hiển vi quang học.

- Phiếu xét nghiệm ghi rõ họ và tên người bệnh, vị trí lấy dịch, số lượng dịch, màu sắc, thời gian lấy, người thực hiện kỹ thuật, số lượng phiến đồ.

- Sổ hoặc máy tính ghi lại thông tin của từng Người bệnh, đặc điểm tổn thương, kết quả chẩn đoán.

- Các sọt rác đựng rác thải y tế, rác thải thường.

- Máy đo pH.

2.5. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Bệnh phẩm từ chọc hút kim nhỏ, áp lam hoặc tế bào bong, tế bào dịch được phết trên lam kính, cố định đúng cách và gửi về phòng xét nghiệm.

2.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.7. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 45 phút.

2.8. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản cố định bằng cồn tuyệt đối, để khô

- Dung dịch May- Grunwald: 3-5 phút

- Rửa nước chảy 1 phút

- Giemsa 10-20 phút

- Rửa nước chảy

- Để khô

4.2. Nhận định kết quả

- Về cơ bản, tính chất bắt màu của các thành phần tế bào như sau:

+ Các thành phần có tính acid của tế bào bắt màu xanh (xanh metylen).

+ Các thành phần kiềm của tế bào bắt màu đỏ da cam.

- Hồng cầu: màu hồng tím đến trung bình, không có màu xám hoặc màu xanh.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Tuân thủ đúng độ pH của phẩm nhuộm từ 6,5 - 6,8. Nếu độ pH kiềm quá hay acid quá đều gây sai lạc tính chất bắt màu của các tế bào. Bởi vậy, cần kiểm tra độ pH trước khi nhuộm. Nếu độ pH thấp, cần điều chỉnh bằng dung dịch đệm có pH 7,2.

- Cần tuân thủ thời gian nhuộm, nếu thời gian nhuộm ngắn hoặc quá dài đều ảnh hưởng đến chất lượng chẩn đoán…

- Phẩm nhuộm May-Grünwald - Giemsa rất dễ cháy và độc với da, đường hô hấp, đường tiêu hóa (nếu chẳng may nuốt phải). Bởi vậy, phải đóng kín miệng lọ phẩm nhuộm, tránh xa lửa, không hút thuốc trong khi nhuộm. Khi tiến hành nhuộm, cần có khẩu trang, găng tay bảo hộ. Nếu chẳng may khi tiếp xúc, cảm thấy nguy hiểm cần khám và tư vấn Bác sĩ.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

44. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM XANH TOLUIDINE

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm xanh Toluidine

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Thuốc nhuộm có ái lực cao với các thành phần mô có tính acid, do đó nhuộm các mô giàu DNA và RNA, làm nổi bật các thành phần như hạt tế bào mast, chất nhày và sụn

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư:

- Lưỡi dao cắt lát mỏng;

- Lam kính sạch;

- Lamen.

2.3. Hoá chất

- Dung dịch tẩy nến

- Dung dịch dầu khoáng

- Dung dịch rửa

- Bộ kít nhuộm xanh toluidine

2.4. Trang thiết bị:

- Máy cắt lát mỏng

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Kính hiển vi quang học

- Máy nhuộm đặc biệt

2.5. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Bệnh phẩm từ chọc hút kim nhỏ, áp lam hoặc tế bào bong, tế bào dịch được phết trên lam kính, cố định đúng cách và gửi về phòng xét nghiệm.

2.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.7. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 1h30 phút.

2.8. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm .

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

- Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

- Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

4.2. Nhận định kết quả

Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh giá trên kính hiển vi quang học:

+ Tế bào mast: Đỏ tía;

+ Chất nền: Màu xanh.

4. 3. Trả kết quà và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá

+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

45. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM XANH LUXOL/NISEELL

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm xanh Luxol/ Nisell.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Trong chẩn đoán bệnh lý thần kinh, cả hai kỹ thuật nhuộm Luxol và Nisseel thường được sử dụng kết hợp để cung cấp một cái nhìn toàn diện về tổn thương thần kinh.

Myelin là lớp vật liệu giàu chất béo (lipid) và protein bao bọc xung quanh sợi trục của tế bào thần kinh, hoạt động như một lớp cách điện để bảo vệ và giúp các tín hiệu thần kinh được dẫn truyền nhanh chóng, hiệu quả. Lớp bảo vệ này được tạo ra bởi các tế bào thần kinh đệm, như tế bào Schwann và tế bào oligodendrocyte.

Nhuộm xanh Luxol cho thấy thuốc nhuộm liên kết mạnh với các thành phần mỡ trong myelin, cho phép quan sát rõ ràng các vùng mất myelin dưới kính hiển vi. Trong khi nhuộm Nisseel là nhuộm màu xanh các cấu trúc chứa RNA, bao gồm cả ribosome trong các thể Nissl, giúp quan sát sự suy giảm của tế bào thần kinh, xác định mức độ và bản chất của bệnh lý.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Lamen , keo gắn lamen.

2.3. Hoá chất:

- Dung dịch tẩy nến

- Dung dịch dầu khoáng

- Dung dịch rửa

- Bộ kít nhuộm xanh Luxol/ Nisell

2.4. Trang thiết bị:

- Máy cắt lát mỏng

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Kính hiển vi quang học

- Máy nhuộm đặc biệt

2.5. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm đã được trong vùi paraffin.

2.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.7. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 1h30 phút.

2.8. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm .

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

- Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

- Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

4.2. Nhận định kết quả

Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh giá trên kính hiển vi quang học: các sợi myelin có màu xanh lam, với các vùng có nồng độ myelin cao nhất có màu sẫm hơn. Vết nhuộm màu xanh lam xuất hiện trên nền trắng

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá

+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

Đảm bảo chất lượng xét nghiệm theo quy định Bộ Y Tế

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

46. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Quy trình này giúp phát hiện các vi khuẩn có trên mẫu mô vùi nến dựa vào sự bắt màu của các vi khuẩn với thuốc nhuộm.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Khi vi khuẩn được nhuộm với thuốc nhuộm ban đầu Crystal Violet (CV-tinh thể tím) và được cố định bằng chất gắn màu, một số vi khuẩn có thể giữ lại thuốc nhuộm ban đầu và một số bị mất màu bởi cồn (ethanol). Dựa vào màu sắc khác nhau có thể phân biệt vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương trên tiêu bản nhuộm.

Vi khuẩn Gram dương: thành tế bào có một lớp phức hợp protein-đường dày (peptidoglycan) và hàm lượng lipid thấp. Việc khử màu tế bào khiến thành tế bào dày này bị mất nước và co lại, làm bít các lỗ trên thành tế bào và ngăn không cho thuốc nhuộm thoát ra khỏi tế bào. Vì vậy, cồn không thể loại bỏ phức hợp CV-Iodine liên kết với lớp peptidoglycan dày của vi khuẩn gram dương và xuất hiện màu xanh lam hoặc tím.

Vi khuẩn Gram âm: thành tế bào cũng hấp thụ phức hợp CV-Iodine nhưng do lớp peptidoglycan mỏng và lớp ngoài dày được hình thành từ lipid nên phức hợp CV-Iodine bị cuốn trôi. Khi chúng tiếp xúc với cồn, chất khử màu sẽ hòa tan lipid trong thành tế bào, điều này cho phép phức hợp CV-Iodine thoát ra khỏi tế bào. Sau đó, khi nhuộm lại bằng safranin, chúng sẽ có màu đỏ.

Chữ viết tắt

- CV: Tinh thể tím (Crystal Violet)

- HE: Hematoxylin Eosin.

- MSDS: Bảng chỉ dẫn an toàn hóa chất (Material Data Safety Sheets)

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện: Nhân lực trực tiếp

Bác sỹ : 01

Kỹ thuật y: 01

Hộ lý: 01

2.2. Vật tư

2.2.1. Sinh phẩm

2.2.2. Dụng cụ

- Que tãi bệnh phẩm.

- Kẹp không mấu các kích cỡ

- Khay nhôm làm đá lạnh.

- Giá để tiêu bản nằm, đứng.

- Bể nhuộm

- Dụng cụ bằng thủy tinh hoặc bằng nhựa đựng hóa chất sau pha (tùy mỗi loại)

- Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.

- Thùng đựng rác thải y tế (màu vàng)

- Thùng đựng rác thông thường (màu xanh).

2.2.3. Vật tư tiêu hao.

- Dao cắt tiêu bản sử dụng một lần.

- Lam kính tích điện dương super frost.

- Lá kính (lamelle)

- Pipet nhựa

- Hộp đựng rác thải sắc nhọn

- Găng tay không bột tan

- Khẩu trang, mũ, quần áo y tế.

- Bút chì, bút dạ dầu.

- Giấy A4

- Giấy in tem chống thấm nước, hóa chất

- Cuộn mực in tem

- Giấy thấm tiêu bản

- Giấy lau tay

- Túi đựng rác thải các loại.

2.3. Trang thiết bị:

- Máy cắt mảnh bệnh phẩm (máy cắt vi phẫu)

- Máy nhuộm đặc biệt

- Bể dàn tiêu bản

- Máy gắn lamelle tự động

- Máy khuấy từ

- Cân điện tử

- Kính hiển vi quang học (một và nhiều đầu, không và có kết nối camera)

- Tủ ấm

- Tủ hút mùi hóa chất

- Tủ lạnh có ngăn làm đá

- Tủ đựng hóa chất chống cháy lan

- Tủ đựng hóa chất có hệ thống lọc khí, hóa chất

- Tủ lạnh lưu trữ hóa chất nhiệt độ 2-8 °C

- Hệ thống tủ lưu trữ tiêu bản, khối nến.

- Máy in tem/nhãn

- Hệ thống công nghệ thông tin có phần mềm nhận biết bệnh phẩm của toàn bộ quá trình (máy in, máy quét và in barcode, hệ thống thu âm) và lưu trữ mẫu.

- Phòng xét nghiệm: nhiệt độ phòng 21-26 °C, đảm bảo an toàn sinh học

- Hệ thống lavabo cấp thoát nước (có đường thải hóa chất độc hại)

- Máy lọc nước RO 2 lần

- Các trang thiết bị, dụng cụ vệ sinh, làm sạch.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:

- Bệnh phẩm là các mẫu nến cần nhuộm Gram để đánh giá và tiêu bản nhuộm Hematoxylin Eosin (HE) kèm theo.

- Khối nến bệnh phẩm đạt chất lượng cần có các yêu cầu sau:

+ Bệnh phẩm được cố định trong dung dịch formalin trung tính 10% ngay sau khi lấy ra khỏi cơ thể.

+ Quy trình tạo ra khối nến phải đảm bảo đúng thời gian và kĩ thuật.

- Lựa chọn khối nến chứa mẫu bệnh và mẫu chứng nhuộm Gram âm và dương.

- Chuẩn bị các lam kính chuyên dụng có mã số, ký hiệu tương ứng với từng loại tiêu bản nhuộm. Cắt 1-2 lát mẫu bệnh và mẫu chứng với độ dày 3-5µm gắn lên mỗi lam kính.

+ 1 tiêu bản mẫu bệnh nhuộm Gram.

+ 1 tiêu bản mẫu chứng Gram âm.

+ 1 tiêu bản mẫu chứng Gram dương.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm:

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm, loại xét nghiệm yêu cầu.

- Có ghi chẩn đoán lâm sàng, loại mẫu cần làm xét nghiệm.

- Có ghi thời gian chỉ định, họ tên và chữ ký của bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ nhận mẫu và phiếu, người bàn giao và người nhận.

- Đối chiếu chỉ định và mẫu: tên, tuổi, loại bệnh phẩm, vị trí lấy mẫu.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật:

Tổng thời gian ước tính: 72 giờ, trong đó:

- Thời gian chuẩn bị mẫu: 12 giờ

- Thời gian nhuộm: 24 giờ

- Thời gian phân tích kết quả, trả kết quả: 36 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Các cơ sở xét nghiệm Giải phẫu bệnh có đầy đủ tiêu chuẩn.

3. AN TOÀN:

- Thực hiện các biện pháp an toàn theo Sổ tay an toàn của từng phòng xét nghiệm: an toàn sinh học, an toàn điện, an toàn cháy nổ, an toàn hoá chất.

- Thực hiện an toàn sinh học phù hợp tác nhân gây bệnh theo thông tư 41/2016/TT-BYT

- Sử dụng hoá chất sinh phẩm an toàn theo khuyến cáo của nhà sản xuất (tham khảo MSDS).

- Hiệu chuẩn vật tư, thiết bị định kỳ.

- Kiểm soát môi trường: Ánh sáng, tiếng ồn, nhiệt độ, độ ẩm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

4.2. Nhận định kết quả

4.2.1. Phân tích kết quả

- Bác sỹ Giải phẫu bệnh thực hiện đánh giá và phân tích kết quả trên tiêu bản dưới kính hiển vi quang học.

- Đánh giá tiêu bản nhuộm HE, chú ý vùng nghi ngờ có vi khuẩn.

- Đánh giá tiêu bản nhuộm chứng Gram âm và chứng Gram dương:

+ Đạt: Tiếp tục đánh giá tiêu bản nhuộm mẫu bệnh.

+ Không đạt: yêu cầu kiểm tra lại toàn bộ quy trình kĩ thuật, sinh phẩm và cắt nhuộm lại từ đầu.

- Các tiêu chí đánh giá:

+ Vi khuẩn gram dương: xanh lam/tím

+ Vi khuẩn gram âm: đỏ

+ Các phần khác của mô: vàng

+ Nhân: đỏ.

- Các loại vi khuẩn có thể gặp:

+ Vi khuẩn Gram dương: Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Gardnerella, Lactobacillus, Listeria, Mycoplasma, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces ...

+ Vi khuẩn Gram âm: Escherichia coli (E. coli), Salmonella, Shigella, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio, acetic acid bacteria, Legionella …

- Đưa ra kết luận: Nhuộm Gram có/không có vi khuẩn Gram dương/âm.

4.2.2. Báo cáo kết quả xét nghiệm và lưu trữ bệnh phẩm

- Trả kết quả theo các quy trình liên quan. Kết quả có đầy đủ thông tin bệnh phẩm, kỹ thuật, chẩn đoán và người thực hiện. Lưu vào biểu mẫu theo quy định và lưu trữ hồ sơ.

- Lưu khối nến và tiêu bản theo quy trình lưu và hủy bệnh phẩm Giải phẫu bệnh và theo thời gian quy định

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Chứng âm nền:

- Nguyên nhân: tẩy màu thuốc nhuộm chưa đủ

- Khắc phục: Chú ý thời gian tẩy màu đến khi hết màu thuốc nhuộm trên lam.

5.2. Chứng dương âm tính:

- Nguyên nhân: Hóa chất hỏng; tẩy màu quá lâu, mẫu hết không đạt tiêu chuẩn, thực hiện không đúng các bước trong quy trình.

- Khắc phục: Pha lại hóa chất mới; cắt các tiêu bản chứng dương để test lại, và tìm mẫu chứng dương khác nhuộm cùng để đối chứng, tuân thủ đúng theo quy trình kỹ thuật.

5.3. Tiêu bản chỉ nhuộm một phần mẫu bệnh phẩm:

- Nguyên nhân: Mẫu cắt mất mô do kỹ thuật cắt hoặc do máy cắt, dao cắt. Tiêu bản bị bóng nước, tiêu bản nhuộm chưa khô, cắt mẫu trên lam thường. Tiêu bản khi thực hiện nhuộm bị nghiêng hoặc hóa chất bay hơi dẫn đến khô vùng phản ứng. Vùng nào khô sẽ không bắt màu thuốc nhuộm.

- Khắc phục: Dựa vào nguyên nhân để loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng. Khi thấy trên mẫu bệnh phẩm có bóng nước cần loại bỏ bóng, bọt khí, để tiêu bản khô hoàn toàn, cắt mẫu trên lam tích điện dương có chất gắn. Cân bằng lại hệ thống máy, dụng cụ nhuộm. Trong quá trình thực hiện quy trình tiêu bản luôn được để trong hệ thống kín gió….

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm tra chất lượng:

+ Sử dụng mẫu chứng Gram âm và Gram dương đã đánh giá chất lượng

+ Nhuộm Gram trên mẫu chứng khi nhập hoặc thay lô hóa chất, sinh phẩm mới hoặc khi thay đổi quy trình theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Đánh giá chất lượng theo tiêu chí đánh giá ở mục 4.2.1.

+ Nếu chất lượng nhuộm đạt yêu cầu sẽ thực hiện nhuộm cùng mẫu bệnh.

+ Nếu không đạt yêu cầu, cần tìm hiểu nguyên nhân, khắc phục. Sau đó nếu đạt sẽ thực hiện nhuộm cùng mẫu bệnh.

- Thực hiện ngoại kiểm: theo chương trình ngoại kiểm của Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng.

- Hiệu chuẩn và hiệu chỉnh trang thiết bị.

- Kiểm soát điều kiện môi trường.

- Đào tạo thường xuyên nhân viên về kỹ thuật, quản lý chất lượng và có hệ thống quản lý chất lượng theo tiêu chuẩn.

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Quyết định số 5199/QĐ-BYT ngày 25/12/2013 của Bộ Y tế Hướng dẫn Quy trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh – Tế bào học.

2. Quyết định 3376/QĐ-BYT ngày 30/098/2023 của Bộ y tế Ban hành “Đề cương Quy trình kỹ thuật xét nghiệm.

3. Bancroff JD, Gamble M (2008). Theory and Practice of Histological Techniques. Elsevier 6th edition.

4. Suvarna SK, Layton C, Bancroft JD (2019). Theory and Practice of Histological Techniques. Elsevier, 8th edition.

47. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM NGẤM BẠC XEM DƯỚI KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ QUÉT

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Chuẩn bị mô y sinh học và vi sinh vật để soi trên kính hiển vi điện tử quét, quan sát cấu trúc siêu vi thể bề mặt mẫu.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Kỹ thuật này dùng để quan sát bề mặt mẫu kích thước cỡ nanomet dùng trong chẩn đoán, nghiên cứu và soi đặc điểm hình dạng cấu trúc bên ngoài mô.

Nguyên lý của phương pháp là các mô sẽ được cố định, làm khô, mạ phủ bằng kim loại nặng để chùm điện tử electron có thể quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ Giải phẫu bệnh: 01

- Kỹ thuật viên: 02

- Hộ lí: 01

2.2. Vật tư, phương tiện, hoá chất

- Chai, lọ thủy tinh đựng hóa chất và mẫu (Số lượng lọ phụ thuộc vào số lượng mẫu)

- Dung dịch khử khoáng (đối với các mẫu mô xương, răng)

- Dung dịch glutaraldehyde

- Dung dịch đệm cacodylat

- Dung dịch axit Osmic

- Bộ dụng cụ tiểu phẫu (Gồm dao, kéo, nỉa, kẹp có mấu và không mấu)

- Effpendof 0,5ml

- Cồn 96° (để pha các nồng độ khác nhau)

- Cồn tuyệt đối

- Nước cất

- Giấy lọc

- Băng dính cacbon

- Kính phòng hộ,

- Acetone

- T-Butyl

- Isoamyl acetate

- Ống hút nhựa

- Xilanh 5ml

- Găng tay, khẩu trang, kính bảo vệ mắt và quần áo bảo hộ: 02 bộ.

- Dung dịch khử trùng là sạch dụng cụ,

- Kim loại mạ phủ: Vàng, Platinum, Palladium hoặc Chromium...

2.3. Trang thiết bị

- Hệ thống kính hiển vi điện tử quét,

- Máy mạ phủ

- Máy bốc bay hơi

- Máy làm khô mẫu ở điểm tới hạn

- Tủ lạnh, hộp cách nhiệt chứa đá khô hoặc đá lạnh để lưu giữ và vận chuyển mẫu bệnh phẩm.

- Điều hòa nhiệt độ.

- Tủ hút phòng thí nghiệm.

- Kính soi nổi

- Cân vi lượng.

- Vòi nước chảy, các dụng cụ

- Chai thủy tinh có nắp để đựng bệnh phẩm đã pha còn dư lại để đem hủy.

- Bình có chứa dung dịch cố định để lưu bệnh phẩm xét nghiệm thêm.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Với mẫu mô y sinh học tươi

- Lấy bệnh phẩm: Tiến hành như quy trình thường quy giải phẫu bệnh. Việc lấy mẫu được thực hiện bởi các khoa lâm sàng, phòng thí nghiệm, nhà nghiên cứu và gửi bệnh phẩm về các phòng nghiên cứu siêu cấu trúc.

- Thu thập mẫu bệnh phẩm:

+ Đo chiều dài mảnh sinh thiết

+ Vẽ hoặc chụp lại hình ảnh mẫu

+ Mẫu có kích thước 0,5 x 0,5 x 0,5 cm.

+ Cố định ngay trong lọ đựng 3-5ml dung dịch glutaraldehyde 2,5% .

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm:

- Có ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh (họ tên người bệnh, tuổi, giới, tên khoa phòng yêu cầu xét nghiệm),

- Có ghi ngày vào viện, chẩn đoán lâm sàng, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian phương pháp, vị trí, lấy mẫu bệnh phẩm, số lượng bệnh phẩm).

- Có ghi rõ yêu cầu xét nghiệm, tên người yêu cầu xét nghiệm.

- Có phần mô tả đại thể:

+ Loại mô xét nghiệm

+ Vùng lấy bệnh phẩm

+ Số lượng bệnh phẩm lấy xét nghiệm

+ Màu sắc bệnh phẩm

+ Kích thước bệnh phẩm

+ Đặc điểm hình thái diện cắt

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Chuẩn bị mẫu, hóa chất và chất đúc

4.1.1. Chuẩn bị mẫu

- Lấy mẫu từ mô y sinh học:

Lấy mẫu từ mô tươi tốt hơn mô đã được cố định thường quy. Cần nhanh chóng lấy mẫu ngay khi bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể.

Đặt bệnh phẩm lên thớt nhựa cứng hoặc thớt thủy tinh sạch.

Nhỏ vài giọt dung dịch bảo quản glutaraldehyde 2,5% lên vùng khác của tấm thớt, đặt các lát cắt mô lên phía trên và phủ lên trên với vài giọt dung dịch glutaraldehyde 2,5%.

Pha nhỏ các lát cắt thành những khối 1mm³ bằng dao sắc và nhúng bệnh phẩm vào dung dịch glutaraldehyde 2,5% lạnh (4°C).

Lấy 3-5 mảnh mô là đủ. Nếu bệnh phẩm có nhiều vùng tổn thương khác nhau trên đại thể, cần lấy riêng và đưa đến phòng xét nghiệm hiển vi điện tử trong những lọ riêng biệt.

Mô có thể được giữ trong dung dịch cố định dùng cho hiển vi điện tử trong nhiều ngày ở 4°C (không quá 30 ngày) trước khi đưa đến phòng xét nghiệm hiển vi điện tử.

- Lấy mẫu y sinh học từ mô được cố định bảo quản

Mô đã được cố định bảo quản trong formol trung tính 10% và các dung dịch bảo quản khác.

Cắt bỏ lát mỏng 1mm từ bờ của bệnh phẩm nơi tiếp xúc trực tiếp với dung dịch cố định, cho vào trong bình nước ngâm rửa dưới vòi nước sạch liên tục 48h.

Sau đó tiến hành như đối với mô tươi.

- Các mẫu xương: được khử khoáng bằng dung dịch ethylen diamin tetra acetic (EDTA) 5%, thời gian khử khoáng từ 15 đến 20 ngày (thường sử dụng 25 - 30 ml dung dịch EDTA 5% cho một gam xương).

Tiến hành khử khoáng như sau: Dùng một lớp gạc bọc các mẫu xương, lấy một sợi chỉ buộc và treo mẫu lơ lửng trong lọ dung dịch để mẫu được tiếp xúc đều với dung dịch khử khoáng. Hàng ngày lắc đều dung dịch khử khoáng từ 1 đến 2 lần. Sau mỗi tuần thay dung dịch mới. Cuối tuần thứ 2 kiểm tra kết quả khử khoáng bằng các phương pháp sau:

+ Phương pháp cơ học: Dùng kim khâu xuyên vào cạnh mẫu xương, khi kim xuyên qua mà có cảm giác mềm tay là quá trình khử khoáng đã hoàn thành.

+ Phương pháp hoá học: Lấy 1 ml dung dịch amoni oxalat NH₄C₂O₄ 5% hay natri oxalat Na2 C₂O₄ 5%; cho một trong hai dung dịch vào dung dịch khử khoáng, nếu có tủa là sự khử khoáng chưa hoàn thành.

4.1.2. Chuẩn bị dung dịch để rửa và cố định mẫu

- Chuẩn bị đệm cacodylate 0,2M và 0,3M

- Chuẩn bị dung dịch cố định glutaraldehyde 2,5%

- Chuẩn bị dung dịch axit Osmic 1%

- Dung dịch cồn các nồng độ: 50°, 70°, 80°, 85°, 90°, 95°

- Chuẩn bị các dung dịch khác

4.2. Tiến hành xử lý mẫu cho nghiên cứu trên kính hiển vi điện tử quét

Tiến hành nhuộm theo các bước sau:

1. Rửa lại mẫu bằng đệm cacodylat 0,3M, 2 lần x 10 phút/lần.

2. Cố định mẫu trong glutaraldehyd 2,5% trong 12 giờ (để qua đêm), ở 40°C;

3. Rửa mẫu bằng đệm cacodylat 0,1M, 2 lần x 10 phút/lần;

4. Cố định bổ sung bằng axit osmic 1% trong 4-6 giờ), ở 40°C;

5. Rửa lại mẫu bằng đệm cacodylat 0,1M, 2 lần x 10 phút/lần.

6. Khử nước các mẫu theo qui trình:

- Cồn ethanol 50°, 2 lần x 15 phút/lần;

- Cồn ethanol 70°, 2 lần x 15 phút/lần;

- Cồn ethanol 80°, 2 lần x 15 phút/lần;

- Cồn ethanol 90°, 2 lần x 15 phút/lần;

- Cồn ethanol 95°, 2 lần x 15 phút/lần;

- Cồn ethanol 100°, 2 lần x 15 phút/lần.

7. Làm khô mẫu:

Tùy thuộc vào loại mẫu mà áp dụng các phương pháp làm khô khác nhau như sau:

- Làm khô tự nhiên (đối với các mẫu mô có bề mặt tương đối rắn chắc: xương, răng, tóc, móng…) bằng cách khử cồn trong các mẫu xương bằng ether:

+ Cồn ethanol 100°, ether nguyên chất (tỉ lệ 1/1) x 20 phút/lần x1 lần;

+ Ether nguyên chất x 20 phút/lần x 1 lần;

+ Làm khô mẫu trong không khí.

- Làm khô bằng bốc bay (đối với các mẫu mô mềm) bằng cách khử cồn ethanol trong các mẫu mô bằng T – Butyl:

+ Ngâm các mẫu mô trong cồn T - Butyl x 30 phút/lần x 3 lần. Sau lần 3 để trong ngăn đá tủ lạnh 30 phút đến 1 giờ để cồn T - Butyl chuyển dạng tinh thể.

+ Bốc bay cồn T - Butyl trong 2-5h.

- Làm khô tại điểm tới hạn (là phương pháp tối ưu nhất để bảo tồn bề mặt mẫu) được thực hiện bằng máy làm khô tại điểm tới hạn với các bước chính sau:

+ Ngâm các mẫu trong isoamyl acetate;

+ Thay thế isoamyl acetate bằng CO₂ lỏng;

+ Làm bay hơi CO₂ lỏng ở điểm tới hạn.

8. Mạ phủ mẫu:

Gắn mẫu trên đế mang mẫu của kính hiển vi điện tử quét bằng băng dính cacbon, hướng bề mặt quan sát lên trên.

Mạ phủ mẫu bằng vàng/Palladium dày 40-60nm trong thời gian 45 - 60 giây, hoặc có thể mạ phủ mẫu bằng cacbon và sau đó là đồng trên máy mạ phủ mẫu

4.3. Nhận định kết quả

Kết quả được Bác sĩ Giải phẫu bệnh đọc trên kính hiển vi điện tử quét.

Đưa mẫu vào máy, vận hành, soi và chụp ảnh theo quy trình và mục đích cần đánh giá, nghiên cứu.

4.4. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

- Pha mẫu gây tổn thương, bầm rập mẫu; Sử dụng lưỡi dao sắc, cắt gọn 1 thì, không cứa, kéo mẫu. Dùng nỉa chuyên dụng giữ mẫu.

- Cố định nhầm vào dung dịch khác, loại bỏ và lấy lại bệnh phẩm mới

- Không kịp thời cố định ngày trong dung dịch glutaraldehyd, thời gian cố định không đủ. Bệnh phẩm dính vào thành lọ đựng mẫu, không được ngâm trong dung dịch cố định làm hỏng bệnh phẩm: nên cho lượng dung dịch đủ quy định vào lọ trước khi pha và thả bệnh phẩm ngập trong dung dịch, sau đó đậy nắp và lắc đều lọ đựng mẫu.

5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật

- Mạ phủ nhầm mặt cắt và vùng định quan sát: Mạ phủ lại

5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật

+ Tiêu bản nhăn, rách: Có thể do: Chất đúc không đạt yêu cầu, tủ ấm không bảo đảm nhiệt độ, do bản thân mẫu

+ Tiêu bản bị quá nhạt hoặc quá đậm: Kiểm tra lại hóa chất và thời gian nhuộm

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Vi Huyền Trác (1976), Các kỹ thuật hiển vi học, Nhà xuất bản y học, Hà Nội.

2. Jeol – Serving Advanced Technology, A guide to Scanning Microscope Observation

3. Murtey, M. D., & Ramasamy, P. (2016). Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy – Life Sciences. InTech. doi: 10.5772/61720

4. Chris G. Jones (2012), Scanning Electron Microscopy: Preparation and Imaging for SEM, Methods Mol Biol. 2012;915:1-20. doi: 10.1007/978-1-61779-977-8_1.

48. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM TRICHROME BLUE

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Trichrome blue.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Phương pháp nhuộm ba màu theo n.guyên lý giống như nhuộm ba màu theo Masson (1929).

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư:

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Lamen

- Lam kính

2.3. Hoá chất:

- Dung dịch tẩy nến

- Dung dịch dầu khoáng

- Dung dịch rửa

- Keo gắn lamen

- Bộ kít nhuộm Trichrome blue

2.4. Trang thiết bị:

- Tủ ấm 37°C và 56°C

- Tủ hút

- Tủ lạnh

- Máy cắt lát mỏng (Microtome)

- Khay và giá đựng mẫu

- Kính hiển vi quang học

- Máy nhuộm đặc biệt

2.5. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm đã được trong vùi paraffin.

2.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.7. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 1h30 phút.

2.8. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

- Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

- Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

4.2. Nhận định kết quả

Bác sỹ Giải phẫu bệnh thực hiện đánh giá và phân tích kết quả trên tiêu bản dưới kính hiển vi quang học:

- Nhân: Xanh da trời - đen

- Bào tương, sợi cơ và hồng cầu: Đỏ

- Sợi tạo keo: Xanh da trời

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá

+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

49. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GOMORI METHENAMINE SILVER

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm gomori methenamine silver .

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Nguyên lý phương pháp nhuộm giống như nhuộm PAS: : nhóm các chất phản ứng bị oxy hóa bằng acid chromic hoặc permanganate sẽ tạo ra các aldehyd và người ta có thể phát hiện ra các aldehyd này nhờ vào hiện tượng thủy phân phức chất bạc - methenamine.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01.

- Kỹ thuật Y: 01. - Hộ lý: 01.

2.2. Vật tư:

- Lam kính

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Lamen

2.3. Hoá chất

- Dung dịch tẩy nến

- Dung dịch dầu khoáng

- Dung dịch rửa

- Keo gắn lamen

- Bộ kít nhuộm Gomori Metheamine silver

2.4. Trang thiết bị:

- Tủ ấm 37°C và 56°C

- Tủ hút

- Tủ lạnh

- Máy cắt lát mỏng (Microtome)

- Khay và giá đựng mẫu

- Kính hiển vi quang học

- Máy nhuộm đặc biệt

2.5. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm đã được trong vùi paraffin.

2.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.7. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 1h30 phút.

2.8. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm .

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm;

- Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm;

- Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được;

- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động.

4.2. Nhận định kết quả:

Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh giá trên kính hiển vi quang học:

− Sợi võng: đen

− Nhân: xám nhạt

− Mô khác: phụ thuộc chất nhuộm đối màu

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá

+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

50. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM SẮT

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Sắt .

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Kỹ thuật này dùng trong chẩn đoán các bệnh, tổn thương liên quan đến chuyển hóa và lắng động sắt ở các mô, cơ quan, tổ chức.... Việc tẩm dung dịch kim loại sắt sẽ dừng lại khi màu sắc mảnh cắt đạt được màu mong muốn và được thực hiện hoàn toàn trên máy nhuộm tự động.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư:

- Lam kính

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Lamen

2.3. Hoá chất

* Đối với quy trình nhuộm thủ công :

- Dung dịch tẩy nến ( xylen hoặc toluen)

- Dung dịch acid acetic 12%.

- Dung dịch mẹ hydroxit sắt dạng keo

- Dung dịch Ferrocyanua Kali (2%)

- HCl (2%)

- keo gắn lamen

* Đối với quy trình nhuộm máy:

- Bộ kit nhuộm sắt

2.4. Trang thiết bị:

- Tủ ấm 37°C và 56°C

- Tủ hút

- Tủ lạnh

- Điều hòa nhiệt độ

- Máy cắt lát mỏng (Microtome)

- Khay và giá đựng mẫu

- Kính hiển vi quang học

- Máy nhuộm đặc biệt

2.5. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm đã được trong vùi paraffin.

2.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.7. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 1h30 phút.

2.8. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

* Đối với quy trình nhuộm thủ công :

+ Tẩy parafin các mảnh cắt bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút.

+ Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút.

+ Rửa nước.

+ Nhúng mảnh cắt rất nhanh vào dung dịch acid acetic 12%.

+ Không rửa; đặt các mảnh cắt vào trong dung dịch làm việc khoảng 1 giờ.

+ Rửa trong 4 bể acid acetic 12% (3 phút mỗi bể).

+ Đặt mảnh cắt vào trong dung dịch Ferrocyanua Kali (2%) + HCl (2%) với thể tích bằng nhau, khoảng 20 phút.

+ Rửa nước chảy rồi qua nước cất.

+ Nhuộm nhân bằng đỏ nhân trong 3 - 10 phút.

+ Rửa trong nước chảy, rồi nước cất.

+ Làm mất nước nhanh bằng cồn 95º và cồn tuyệt đối.

+ Làm trong bằng 3 bể toluen sạch.

+ Gắn lamen bằng dung dịch gắn.

* Đối với quy trình nhuộm máy :

+ Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

+ Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

+ Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

4.2. Nhận định kết quả

Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh giá trên kính hiển vi quang học: Mucopolysaccarit acid bắt màu xanh đậm.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

+ Tiêu bản bị đen: cắt dày quá

+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

51. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM CHẤT ĐỒNG

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm đồng trên máy nhuộm đặc biệt tự động.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Kỹ thuật này dùng trong chẩn đoán các bệnh, tổn thương liên quan đến chuyển hóa và lắng động đồng ở các mô, cơ quan, tổ chức.... Việc tẩm dung dịch kim loại đồng sẽ dừng lại khi màu sắc mảnh cắt đạt được màu mong muốn và được thực hiện hoàn toàn trên máy nhuộm tự động.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y: 01

- Hộ lý 01

2.2. Vật tư:

- Lam kính

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Lamen

2.3. Hoá chất

- Dung dịch tẩy nến ( xylen hoặc toluen)

- Dung dịch rửa

- Bộ kít nhuộm đồng

- Keo gắn lamen

2.3. Trang thiết bị:

- Tủ ấm 37°C và 56°C

- Tủ hút

- Tủ lạnh

- Điều hòa nhiệt độ

- Máy cắt lát mỏng (Microtome)

- Khay và giá đựng mẫu

- Kính hiển vi quang học

- Máy nhuộm đặc biệt

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm đã được trong vùi paraffin.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 1h30 phút.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh.

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

- Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

- Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

4.2. Nhận định kết quả

Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh giá trên kính hiển vi quang học: chất đồng tích tụ thành phức hợp có màu xanh đen hoặc nâu đen trong mô.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

+ Tiêu bản bị bong: cắt dày quá, cố định thời gian chưa đảm bảo…

+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: Kiểm tra lại dung dịch rửa và bộ kit nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

52. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM BẠC CHO THẬN BẰNG PHƯƠNG PHÁP XANH JONES

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Jones methamine silver.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Kỹ thuật này dùng trong chẩn đoán các bệnh, tổn thương liên quan thận, sử dụng kỹ thuật nhuộm màng đáy cầu thận để phát hiện tổn thương của nó, Oxy hóa các thành phần Carbohydrate của màng đáy tạo ra aldehyde bằng Periodic acid. Các aldehyde được giải phóng sẽ khử bạc thành bạc kim loại có thể nhìn thấy được. Việc tẩm dung dịch kim loại sẽ dừng lại khi màu sắc mảnh cắt đạt được màu mong muốn.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư:

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Lamen

- Giấy lọc

- Lam kính

- Giá đựng tiêu bản, bút ghi nhãn, giấy thấm

- Bể nhuộm

2.3. Hoá chất

- Acid periodic 0,5%

- Vàng Chloride 0.5%

- Thiosulphate sodium 5%

- Dung dịch nhuộm bạc thận (Renal Silver Bath – RSB)

+ 40ml Hexamine 3% (trữ ở nhiệt độ phòng)

+ 2ml Bạc nitrat 5% (trữ ở tủ lạnh)

+ 6ml Borax 5% (trữ ở nhiệt độ phòng)

- Hematoxylin, Green Fast

- Keo gắn lamen

- Đối với trường hợp nhuộm máy tự động: bộ kit test có sẵn của hãng đã bao gồm đầy đủ dung dịch nhuộm.

2.3. Trang thiết bị:

- Máy cắt lát mỏng

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Máy đo độ pH

- Kính hiển vi quang học

- Tủ lạnh

- Pipet

- Cân vi lượng

- Khay, giá, Lọ thủy tinh đựng hóa chất...

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm đã được trong vùi paraffin.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 1h30 phút.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Khoa giải phẫu bệnh.

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

(*) Đối với quy trình nhuộm thủ công:

+ Đối chiếu mã số bệnh nhân trên lam kính và trên phiếu chỉ định sau đó thực hiện kỹ thuật:

+ Tiêu bản tẩy nến như thường lệ sau đó rửa nước chảy: 5 phút

+ Phủ dung dịch Acid Periodic 0.5%: 30 phút

+ Rửa kĩ bằng nước cất: 5 phút

+ Cho tiêu bản vào bể nhựa có chứa dung dịch RSB, cho bể nhựa vào cốc nước

ấm 80°C, cho cốc nước vào tủ ấm 70°C: 20 phút

+ Kiểm tra tiêu bản xem đủ đậm màu chưa, nếu chưa đợi đến khi đủ đậm màu rồi rửa kĩ bằng nước cất: 5 phút

+ Phủ Vàng chloride 0.5% lên tiêu bản: 1 phút

+ Rửa kĩ bằng nước cất: 5 phút

+ Phủ Thiosulphate sodium 5% lên tiêu bản: 1 phút

+ Rửa kĩ bằng nước cất: 5 phút

+ Nhuộm Hematoxylin

+ Nhuộm Green fasst

+ Rửa nước

+ Khử nước → làm trong bằng xylen → gắn bôm

(*) Đối với quy trình nhuộm máy

+ Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

+ Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

+ Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

4.2. Nhận định kết quả

Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh giá trên kính hiển vi quang học:

+ Màng đáy: Đen;

+ Nhân: Xanh lam/tía;

+ Bào tương: xanh

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

+ Tiêu bản bị đen: cắt dày hoặc để thời gian nhuộm RSB quá lâu: cắt mỏng, giảm thời gian nhuộm RSB

+ Dung dịch RSB là chất oxy hóa có độc tính cao, do đó khi tiếp xúc với dung dịch phải cẩn thận, phải đeo khẩu trang, găng tay, ở nơi thoáng gió.

+ Tiêu bản bị nhạt, không rõ màu đen: pha dung dịch RSB chưa đúng tỉ lệ, thời gian ủ chơi đủ hoặc dung dịch bạc hết hạn sử dụng.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

53. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM PAS

(Periodic Acid Schiff)

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Acid Periodic Schiff trên mẫu mô bệnh học.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Đây là kỹ thuật nhuộm phát hiện nấm và chất nhầy với nguyên lý dùng tác nhân oxy hóa là acid periodic để phá vỡ mối liên kết của 2 nguyên tử các bon (các nhóm glycol 1-2, hydro-1 amino-2, hydroxy-1 alkylamino-2, hydroxyl -1ceto-2…) làm xuất hiện các nhóm aldehyt. Các nhóm aldehyt này nhìn được nhờ phản ứng với thuốc thử Schiff.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật Y: 01

- Hộ lý: 01

2.2. Vật tư:

- Lưỡi dao cắt lát mỏng.

- Giấy lọc.

- Lam kính, lamen.

- Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.

2.3. Hoá chất

- Cồn tuyệt đối

- Dung dịch tẩy nến ( xylen hoặc toluen)

- Các hóa chất để thực hiện nhuộm: thuốc thử Shiff, acid periodic, Hematoxyline.

2.4. Trang thiết bị:

- Máy đo độ pH điện tử.

- Máy chuyển bệnh phẩm tự động.

- Máy đúc khối parafin.

- Bàn hơ dùng điện.

- Máy cắt lát mỏng (microtome).

- Tủ ấm 37° và 56°.

- Tủ lạnh.

- Điều hòa nhiệt độ.

- Tủ hốt phòng thí nghiệm.

- Bể nhuộm.

- Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).

- Kẹp không mấu, kéo.

- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.

2.5. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm đã được trong vùi paraffin.

2.6. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.7. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 1h30 phút.

2.8. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Khối nến chứa bệnh phẩm được cắt mỏng 3-4 micromet trên lam kính.

- Tiến hành kỹ thuật nhuộm:

Tẩy parafin bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút.

Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80°, 70° mỗi bể 2 phút.

Ngâm trong nước cất: 10 phút.

Oxy hóa trong acid periodic 1%: 10 phút.

Rửa nước chảy: 5 – 10 phút rồi cho vào nước cất.

Ngâm trong thuốc thử Schiff: 15- 30 phút (hoặc thấy có màu hồng là được).

Nhuộm nhân bằng hemalum Mayer: khoảng 1phút.

Rửa nước chảy trong 5 phút. Đẩy nước bằng cồn 95° và 100°

Làm trong qua 3 bể toluen sạch

Gắn lamen bằng bôm như thường lệ

4.2. Nhận định kết quả

Kết quả được Bác sĩ đọc và đánh giá trên kính hiển vi quang học:

+ Nhân tế bào: Xanh đen

+ Nấm, chất nhày: Hồng đậm tới đỏ

+ Glycoprotein: Đỏ

+ Glycogen: Đỏ

+ Chất nền: màu ve

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Tiêu bản gấp, xước, rách, nhăn

- Chất lượng thuốc thử shiff và nồng độ acid periodic cần được kiểm tra thường xuyên

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

3. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

54. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM PERIODIC ACID SCHIFF DIASTATE (PAS – D).

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Phân biệt các thành phần chứa glycogen (Ví dụ: tế bào gan, đại thực bào, thể vùi) với các thành phần chứa carbohydrate khác (như chất nhầy, tinh bột, nấm, màng đáy, sợi võng) khi cùng bắt màu nhuộm Periodic Acid Schiff (PAS).

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Kỹ thuật nhuộm PAS-D thường thực hiện sau khi nhuộm PAS bắt màu đỏ với các thành phần chứa carbohydrate trong mô (ví dụ: glycogen, chất nhầy, tinh bột). Đây là một trong những kỹ thuật tiêu enzym giúp loại bỏ glycogen ra khỏi mô, các phân tử glycogen dưới tác động của enzym tiêu glycogen α-Amylase sẽ bị phá vỡ thành các phân tử nhỏ hơn (maltose và glucose) dễ bị rửa trôi và mất màu đỏ của thuốc nhuộm PAS.

Chữ viết tắt

- HE: Hematoxylin Eosin.

- MSDS: Bảng chỉ dẫn an toàn hóa chất (Material Data Safety Sheets)

- PAS: Periodic Acid Schiff

- PAS-D: Periodic Acid Schiff- Diastase

2. CHUẨN BỊ

2.1. Nhân lực

Bác sỹ: 01

Kỹ thuật y: 01

Hộ lý: 01

2.2. Vật tư

2.2.1. Sinh phẩm

2.2.2. Dụng cụ

- Que tãi bệnh phẩm.

- Kẹp không mấu các kích cỡ

- Khay nhôm làm đá lạnh.

- Giá để tiêu bản nằm, đứng.

- Bể nhuộm

- Dụng cụ bằng thủy tinh hoặc bằng nhựa đựng hóa chất sau pha (tùy mỗi loại)

- Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.

- Thùng đựng rác thải y tế (màu vàng)

- Thùng đựng rác thông thường (màu xanh).

2.2.3. Vật tư tiêu hao.

- Dao cắt tiêu bản sử dụng một lần.

- Lam kính tích điện dương super frost.

- Lá kính (lamelle)

- Pipet nhựa

- Hộp đựng rác thải sắc nhọn

- Găng tay không bột tan

- Khẩu trang, mũ, quần áo y tế.

- Bút chì, bút dạ dầu.

- Giấy A4

- Giấy in tem chống thấm nước, hóa chất

- Cuộn mực in tem

- Giấy thấm tiêu bản

- Giấy lau tay

- Túi đựng rác thải các loại.

2.3. Trang thiết bị:

- Máy cắt mảnh bệnh phẩm (máy cắt vi phẫu)

- Máy nhuộm đặc biệt

- Bể dàn tiêu bản

- Máy gắn lamelle tự động

- Máy khuấy từ

- Cân điện tử

- Kính hiển vi quang học (một và nhiều đầu, không và có kết nối camera)

- Tủ ấm

- Tủ hút mùi hóa chất

- Tủ lạnh có ngăn làm đá

- Tủ đựng hóa chất chống cháy lan

- Tủ đựng hóa chất có hệ thống lọc khí, hóa chất

- Tủ lạnh lưu trữ hóa chất nhiệt độ 2-8°C

- Hệ thống tủ lưu trữ tiêu bản, khối nến.

- Máy in tem/nhãn

- Hệ thống công nghệ thông tin có phần mềm nhận biết bệnh phẩm của toàn bộ quá trình (máy in, máy quét và in barcode, hệ thống thu âm) và lưu trữ bệnh phẩm.

- Phòng xét nghiệm: nhiệt độ phòng 21-26°C, đảm bảo an toàn sinh học

- Hệ thống lavabo cấp thoát nước (có đường thải hóa chất độc hại)

- Máy lọc nước RO 2 lần

- Các trang thiết bị, dụng cụ vệ sinh, làm sạch.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:

- Bệnh phẩm là mẫu nến cần nhuộm PAS-D để đánh giá.

- Các tiêu bản kèm theo gồm:

+ 1 tiêu bản mẫu bệnh nhuộm Hematoxylin Eosin (HE)

+ 1 tiêu bản mẫu bệnh nhuộm PAS dương tính.

- Mẫu nến chứa bệnh phẩm đạt chất lượng cần có các yêu cầu sau:

+ Bệnh phẩm được cố định trong DD formalin trung tính 10% ngay sau khi lấy ra khỏi cơ thể.

+ Quy trình tạo ra mẫu nến phải đảm bảo đúng kỹ thuật.

- Chuẩn bị các lam kính chuyên dụng có mã số, ký hiệu tương ứng với từng loại tiêu bản nhuộm. Cắt từ mẫu nến 1-2 lát với độ dày 3-5µm gắn lên mỗi lam kính.

+ 1 tiêu bản mẫu bệnh để nhuộm PAS-D tương ứng tiêu bản nhuộm PAS dương tính.

+ 1 tiêu bản mẫu chứng PAS-D âm.

+ 1 tiêu bản mẫu chứng PAS-D dương.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm:

- Có đầy đủ thông tin về người bệnh (họ tên, tuổi, giới, địa chỉ, điện thoại), khoa phòng yêu cầu xét nghiệm, loại xét nghiệm yêu cầu.

- Có ghi chẩn đoán lâm sàng, loại mẫu cần làm xét nghiệm.

- Có ghi thời gian chỉ định, họ tên và chữ ký của bác sĩ yêu cầu xét nghiệm.

- Ghi ngày giờ nhận mẫu và phiếu, người bàn giao và người nhận.

- Đối chiếu chỉ định và mẫu: tên, tuổi, loại bệnh phẩm, vị trí lấy mẫu.

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật:

Tổng thời gian ước tính: 72 giờ, trong đó:

- Thời gian chuẩn bị mẫu: 12 giờ

- Thời gian nhuộm: 24 giờ

- Thời gian phân tích kết quả, trả kết quả: 36 giờ.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Các cơ sở xét nghiệm Giải phẫu bệnh có đầy đủ tiêu chuẩn.

3. AN TOÀN:

Thực hiện theo tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1 Các bước thực hiện

4.2. Nhận định kết quả

4.2.1. Phân tích kết quả

- Bác sỹ Giải phẫu bệnh thực hiện đánh giá và phân tích kết quả trên tiêu bản dưới kính hiển vi quang học.

- Đánh giá tiêu bản nhuộm HE và PAS nhằm xác định vùng tổn thương.

- Nội kiểm tra đánh giá tiêu bản nhuộm chứng âm và chứng dương:

+ Đạt: Tiếp tục đánh giá tiêu bản nhuộm mẫu bệnh.

+ Không đạt: yêu cầu kiểm tra lại toàn bộ quy trình kỹ thuật, sinh phẩm và cắt nhuộm lại từ đầu.

+ Tiêu chí đánh giá: Nhân tế bào bắt màu xanh tím. Thành phần chứa glycogen trong bào tương không bắt màu hoặc bắt màu hồng nhạt. Thành phần không phải glycogen trong bào tương bắt màu đỏ sáng.

- Đánh giá tiêu bản nhuộm mẫu bệnh theo các tiêu chí:

+ Tế bào/ thành phần cần đánh giá dương tính hay âm tính

+ Vị trí dương tính (ổ hay lan tỏa).

+ Mức độ dương tính (nếu cần).

- Đưa ra kết luận: Nhuộm PAS-D dương tính hay âm tính cho thành phần nào.

4.2.2. Báo cáo kết quả xét nghiệm và lưu trữ bệnh phẩm

- Trả kết quả theo các quy trình liên quan. Kết quả có đầy đủ thông tin bệnh phẩm, kỹ thuật, chẩn đoán và người thực hiện. Lưu vào biểu mẫu theo quy định và lưu trữ hồ sơ.

- Lưu khối nến và tiêu bản theo quy trình lưu và hủy bệnh phẩm Giải phẫu bệnh và theo thời gian quy định.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Chứng âm nền:

- Nguyên nhân: thời gian khử glycogen thành các phân tử nhỏ hơn như glucose, maltose chưa đủ.

- Khắc phục: Chú ý thời gian phủ dung dịch enzym Amylase tuân thủ đúng, đảm bảo đúng nồng độ và điều kiện môi trường.

5.2. Chứng dương âm tính:

- Nguyên nhân: Hóa chất hỏng; tẩy màu quá lâu, mẫu hết không đạt tiêu chuẩn, thực hiện không đúng các bước trong quy trình.

- Khắc phục: Pha lại hóa chất mới; cắt các tiêu bản chứng dương để test lại, và tìm mẫu chứng dương khác nhuộm cùng để đối chứng, tuân thủ đúng theo quy trình kỹ thuật.

5.3. Tiêu bản chỉ nhuộm một phần mẫu bệnh phẩm:

- Nguyên nhân: Mẫu cắt mất mô do kỹ thuật cắt hoặc do máy cắt, dao cắt. Tiêu bản bị bóng nước, tiêu bản nhuộm chưa khô, cắt mẫu trên lam thường. Tiêu bản khi thực hiện nhuộm bị nghiêng hoặc hóa chất bay hơi dẫn đến khô vùng phản ứng. Vùng nào khô sẽ không bắt màu thuốc nhuộm.

- Khắc phục: Dựa vào nguyên nhân để loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng. Khi thấy trên mẫu bệnh phẩm có bóng nước cần loại bỏ bóng, bọt khí, để tiêu bản khô hoàn toàn, cắt mẫu trên lam tích điện dương có chất gắn. Cân bằng lại hệ thống máy, dụng cụ nhuộm. Trong quá trình thực hiện quy trình tiêu bản luôn được để trong hệ thống kín gió.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm tra chất lượng:

+ Sử dụng mẫu chứng âm và mẫu chứng dương đã đánh giá chất lượng

+ Nhuộm PAS-D trên mẫu chứng khi nhập hoặc thay lô hóa chất, sinh phẩm mới hoặc khi thay đổi quy trình theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Đánh giá chất lượng theo tiêu chí đánh giá ở mục 4.2.1.

+ Nếu chất lượng nhuộm đạt yêu cầu sẽ thực hiện nhuộm cùng mẫu bệnh.

+ Nếu không đạt yêu cầu, cần tìm hiểu nguyên nhân, khắc phục và đánh giá lại. Sau đó nếu đạt sẽ thực hiện nhuộm cùng mẫu bệnh.

- Thực hiện ngoại kiểm: theo chương trình ngoại kiểm của Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng.

- Hiệu chuẩn và hiệu chỉnh trang thiết bị

- Kiểm soát điều kiện môi trường

- Đào tạo thường xuyên nhân viên về kỹ thuật, quản lý chất lượng và có hệ thống quản lý chất lượng theo tiêu chuẩn.

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Quyết định số 5199/QĐ-BYT ngày 25/12/2013 của Bộ Y tế Hướng dẫn Quy trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh – Tế bào học

2. Dongtao A Fu, Martha Campbell-Thompson (2017). Periodic Acid-Schiff Staining with Diastase, 1639:145-149. doi: 10.1007/978-1-4939-7163-3

3. Mc Manus (1992). Diastase digestion. Laboratory methods in histopathology - AFIP:153.

4. Bancroff JD, Gamble M (2008). Theory and Practice of Histological Techniques. Elsevier 6th edition:182-190.

5. Suvarna SK, Layton C, Bancroft JD (2019). Theory and Practice of Histological Techniques. Elsevier, 8th edition.

55. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HEMATOXYLIN EOSIN TRÊN TIÊU BẢN MÔ

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện xét nghiệm và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm hai màu Hematoxylin Eosin.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Đây là phương pháp nhuộm đơn giản, phối hợp hai màu liên tiếp. Nhuộm nhân theo nguyên tắc tăng dần bằng phẩm nhuộm Hematoxylin có tính baze, nhuộm bào tương theo nguyên tắc giảm dần bằng phẩm nhuộm Eosin có tính acid.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý.

2.2. Hóa chất, Vật tư:

- Các hóa chất để thực hiện cố định bệnh phẩm: Formol 10%; Formol đệm trung tính 10%, Bouin...

- Các vật tư, hóa chất để thực hiện chuyển, xử lý bệnh phẩm, nhuộm màu: miếng lót bệnh phẩm, casset, bút ghi cassett, Cồn tuyệt đối, Xylen, Toluen, Paraffin, Hematoxylin, Eosin, Lithiumcarbonat, acid HCL, keo gắn lamen, lamen, lam kính, dao cắt mảnh...

- Kính phòng hộ, găng tay các loại.

2.3. Trang thiết bị:

- Máy đo pH điện tử.

- Máy chuyển, xử lý bệnh phẩm tự động.

- Máy nhuộm tiêu bản tự động

- Máy đúc khối Paraffin.

- Bàn hơ tiêu bản.

- Máy cắt lát mỏng (microtome).

- Tủ ấm 37° và 56°.

- Tủ lạnh.

- Điều hòa nhiệt độ.

- Tủ hút mùi phòng thí nghiệm.

- Bể nhuộm.

- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Là các khối nến chứa mẫu bệnh phẩm đã qua quá trình cố định – chuyển – đúc.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 1h30 phút.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Khối nến chứa bệnh phẩm cần xét nghiệm được cắt mảnh và dán mảnh

- Tiến hành kỹ thuật nhuộm:

+ Tẩy paraffin trong 3 bể toluen (hoặc xylen), mỗi bể 5 phút.

+ Qua 4 bể cồn giảm dần: 100º - 95º - 80º - 70º, mỗi bể nhúng 15 lần.

+ Rửa nước: nhúng 15 lần.

+ Nhuộm nhân bằng Hematoxylin: 3-5 phút hoặc lâu hơn.

+ Rửa nước chảy: 5-10 phút.

+ Kiểm tra màu của nhân qua kính hiển vi, nếu đậm, tẩy nhẹ bằng cồn-acid.

+ Rửa nước chảy: 1 phút.

+ Nhuộm Eosin1%: 1 -2 phút.

+ Rửa nước chảy: 1 phút.

+ Biệt hoá trong 2 bể cồn 95º - 100º, mỗi bể 15 lần nhúng.

+ Qua 3 bể toluen, bể I và II nhúng 15 lần, bể III: 5-10 phút.

+ Gắn lamen

- Ngoài ra có thể thực hiện các bước nhuộm theo quy trình cài đặt sẵn trên máy nhuộm tiêu bản tự động sau khi tiêu bản được cắt mảnh dán trên lam kính.

- Kết quả:

Nhân tế bào: xanh đến xanh đen

Bào tương tế bào: hồng đến đỏ Hồng cầu: hồng đậm Sợi tạo keo: hồng nhạt

4.2. Nhận định kết quả

- Bác sỹ Giải phẫu bệnh thực hiện đánh giá và phân tích kết quả trên tiêu bản dưới kính hiển vi quang học.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Bào tương và nhân đều bắt màu nhạt: thuốc nhuộm cũ, thay thuốc nhuộm mới.

- Nhân nhạt màu: tăng thời gian nhuộm nhân.

- Nhân đậm màu quá mức: tẩy nhẹ bằng cồn-acid.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

56. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GIEMSA TRÊN MẢNH CẮT MÔ PHÁT HIỆN HP

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện xét nghiệm và chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm giemsa trên mẫu mô bệnh học nhằm phát hiện vi khuẩn HP (Helicobacter pylori) .

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Sử dụng thuốc nhuộm giemsa để phát hiện các vi khuẩn Helicobacter pylori bắt màu tím đỏ ở khe tuyến, vùng chất nhầy trên bề mặt biểu mô phủ dạ dày.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý.

2.2. Hóa chất, Vật tư:

- Các vật tư, hóa chất để thực hiện cố định chuyển, xử lý bệnh phẩm, nhuộm màu: Cồn, Giemsa, nước cất, keo gắn lamen, lưỡi dao cắt lát mỏng…

- Bể nhuộm.

- Khuôn nhựa.

- Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).

- Kẹp không mấu, kéo.

- Giấy lọc.

- Lam kính, lamen

- Kính phòng hộ, găng tay các loại.

2.3. Trang thiết bị:

- Máy đo pH điện tử.

- Máy chuyển, xử lý bệnh phẩm tự động.

- Máy đúc khối parafin.

- Bàn hơ tiêu bản

- Máy cắt lát mỏng (microtome).

- Tủ ấm 37° và 56°.

- Tủ lạnh.

- Điều hòa nhiệt độ.

- Tủ hút phòng xét nghiệm.

- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Mẫu bệnh phẩm thực hiện xét nghiệm này là các khối nến chứa mẫu phẩm cần xét nghiệm

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 1h30 phút.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

+ Khối nến chứa bệnh phẩm được cắt mảnh và dán mảnh;

- Tiến hành kỹ thuật nhuộm Giêmsa;

+ Khi dùng, lấy Giemsa mẹ pha loãng với nước cất, tỷ lệ Giemsa/nước cất là 1/4. Lưu ý là độ pH nên bằng 7,2 và được điều chỉnh bằng đệm photphat.

+ Mảnh cắt được tẩy nến như thường lệ (qua xylen, hoặc toluen, cồn).

+ Rửa nước.

+ Nhuộm tiêu bản trong dung dịch Giemsa đã pha loãng trong 30 phút đến 1 giờ.

+ Rửa nước

+ Biệt hóa trong acid acetic loãng (1 giọt acid acetic với 100ml nước cất)

+ Rửa nước

+ Loại phẩm thừa bằng cồn 95°

+ Loại nước bằng cồn và làm trong bằng xylen

+ Gắn lamen

- Kết quả:

Các vi khuẩn Helicobacter pylori (HP) bắt màu tím đỏ.

4.2. Nhận định kết quả

Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ (kết hợp cùng tiêu bản nhuộm Hematoxylin – Eosin), từ đó đưa ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh...

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Các mảnh cắt quá dầy, không có phần niêm mạc sẽ không phát hiện được HP.

- Dung dịch dán mảnh cắt bị nhiễm khuẩn: sẽ ngộ nhận các vi khuẩn khác với HP, trường hợp này cần thay dung dịch dán mảnh cắt.

- Thời gian nhuộm lâu hoặc nồng độ Giemsa cao đều làm cho mô bắt màu mạnh, chuyển màu xanh đen, khó nhận định kết quả, xử lý bằng cách làm nhạt màu qua cồn.

- Nước dùng để rửa có nhiều cặn bẩn gây cặn bẩn trên tiêu bản, khó đánh giá kết quả, cần sử dụng nguồn nước sạch và sử dụng lõi lọc nếu cần.

- Thuốc nhuộm cũng có thể bị cặn và nhiễm vi khuẩn làm ảnh hưởng đến việc đánh giá kết quả, nên thay thuốc nhuộm mới.

- Dung dịch Giemsa pha loãng chỉ pha trước khi nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer; 2018.

2. Robert Lott, Janet Tunnicliffe, Elizabeth Sheppard. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology. Version 9.0. College of American Pathologists; 2020.

3. Specimen Collection & Transport Guide. Quest Diagnostic; 2018.

57. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM PAS KẾT HỢP XANH ALCIAN

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Quy trình nhuộm PAS kết hợp Xanh Alcian được sử dụng để phát hiện và phân biệt giữa các loại polysaccharide và glycoprotein trong mô. PAS dùng để nhuộm glycogen và một số glycoprotein, trong khi Xanh Alcian chuyên dùng để nhuộm acid mucopolysaccharide. Kết hợp cả hai giúp xác định vị trí và loại của các thành phần carbohydrate trong mô, hỗ trợ chẩn đoán các tình trạng bệnh lý như fibrosis, các bệnh về gan và bệnh lý tiêu hóa..

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Nhuộm PAS kết hợp Xanh Alcian là một kỹ thuật nhuộm trong mô bệnh học, sử dụng để phân biệt các thành phần carbohydrate trong mô. PAS nhuộm glycogen, glycoprotein, và mucin không chứa acid, tạo ra màu hồng/magenta. Xanh Alcian được dùng để nhuộm acid mucopolysaccharide và glycosaminoglycan, tạo màu xanh. Kết hợp hai phương pháp này cho phép xác định rõ ràng vị trí và loại của các carbohydrate, hỗ trợ chẩn đoán các bệnh lý có liên quan đến các biến đổi của carbohydrate trong mô.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý.

2.2. Vật tư, hóa chất:

- Các vật tư, hóa chất để thực hiện chuyển bệnh phẩm, nhuộm màu: miếng lót bệnh phẩm, casset, bút ghi cassett, Cồn tuyệt đối, Xylen, Toluen, Paraffin, bể nhuộm, giá đựng tiêu bản...

- Các vật tư, hóa chất để thực hiện nhuộm: thuốc thử Shiff, acid periodic, xanh alcian, Hematoxyline, keo gắn phiến kính, phiến kính, lam kính, dao cắt mảnh...

2.3. Trang thiết bị:

- Máy đo độ pH điện tử.

- Máy chuyển bệnh phẩm tự động.

- Máy đúc khối parafin.

- Bàn hơ dùng điện.

- Máy cắt lát mỏng (microtome).

- Lưỡi dao cắt lát mỏng.

- Tủ ấm 37° và 56°.

- Tủ lạnh.

- Điều hòa nhiệt độ.

- Tủ hốt phòng thí nghiệm.

- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.

- Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Cố định: Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể được đưa ngay vào dung dịch cố định (formol đệm trung tính 10%, formol 0%, Bouin…) với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định khuyến cáo nhiều gấp 20-30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 4 - 24 giờ tuỳ theo kích thước mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.

- Sau khi cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:

+ Chuyển bệnh phẩm

+ Vùi Paraffin

+ Đúc khối Paraffin

+ Cắt mảnh và dán mảnh.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 60 phút.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.

3. AN TOÀN

Khi thực hiện nhuộm PAS kết hợp Xanh Alcian, cần tuân thủ các biện pháp an toàn như sử dụng găng tay, kính bảo hộ, và làm việc trong tủ hút khí để tránh tiếp xúc với hóa chất độc hại. Cần bảo quản và xử lý hóa chất cẩn thận, theo dõi và tuân thủ hướng dẫn về an toàn hóa chất và tiêu hủy chất thải theo quy định.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

+ Nhuộm tiêu bản

- Tiến hành kỹ thuật

+ Tẩy parafin bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút.

+ Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80°, 70° mỗi bể 2 phút.

+ Ngâm trong nước cất: 10 phút.

+ Phiến đồ đã cố định, nhuộm 20 phút trong dung dịch nước xanh Alcian 0,1%.

+ Rửa và nhúng 6 phút trong dung dịch nước acid photphomolybdic.

+ Rửa cẩn thận trong nước cất 10 phút.

+ Rửa nước cất 5 phút.

+ Nhuộm thuốc thử Schiff trong 60 phút.

+ Nhúng vào dung dịch Bisunfit Natri 3 lần, cách nhau 20 phút.

+ Rửa nước chảy trong 5 phút.

+ Lần lượt cho qua cồn có nồng độ cao dần (70°, 80°, cồn tuyệt đối).

+ Làm trong và gắn lá kính như thường lệ.

4.2. Nhận định kết quả

- Bác sỹ Giải phẫu bệnh thực hiện đánh giá và phân tích kết quả trên tiêu bản dưới kính hiển vi quang học: Chất nhày acid có màu xanh.

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Tiêu bản bị gấp, xước, rách, nhăn.....

- Chú ý kiểm tra chất lượng acid periodic, thuốc thử schiff, nồng độ xanh alcian...

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

2. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

58. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM DIFF - QUICK

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mục đích của phương pháp này là cung cấp kết quả nhanh chóng, cho phép phân biệt giữa các loại tế bào khác nhau và nhận diện các dấu hiệu bệnh lý, hỗ trợ chẩn đoán lâm sàng trong thời gian ngắn..

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Là phương pháp nhuộm dựa trên sự cải biên của phương pháp nhuộm Wright Giemsa của Bernard Witlin năm 1970. Nó có ưu điểm hơn phương pháp nhuộm Wright Giemsa, vì các bước nhuộm đơn giản hơn, ít tốn thời gian hơn và cho phép tìm bạch cầu ái toan hay ái kiềm bằng cách thay đổi thời gian nhuộm. Vì vậy, nó là phương pháp nhuộm nhanh tế bào và mô, được áp dụng cho nhiều loại bệnh phẩm, từ chọc hút kim nhỏ, phiến đồ Tế bào học bong, phiến đồ Tế bào học áp, tinh dịch đồ. Phiến đồ nhuộm Diff - Quik cần để khô trong không khí trước khi cố định, không cố định khi phiến đồ còn ướt. Phương pháp nhuộm này giúp đánh giá chi tiết bào tương tế bào, các giọt lipid, các hạt chế tiết, chất nhầy, các chất ngoại bào như chất nhầy, các sợi keo. Các thành phần như vi khuẩn, nấm cũng dễ dàng phát hiện được bằng phương pháp nhuộm này.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý.

2.2. Vật tư, hóa chất:

- Dung dịch cố định bệnh phẩm: Cồn tuyệt đối, cồn ete…

- Dung dịch nhuộm: Phẩm nhuộm phiến đồ Diff - Quick

- Nước cất, nước sạch để rửa thuốc nhuộm trên phiến kính.

- Bể nhuộm, giá đựng tiêu bản, lam kính, phiến kính, dung dịch gắn phiến kính…

2.3. Trang thiết bị:

- Máy nhuộm tiêu bản

- Kính hiển vi quang học, bàn có mặt phẳng, đủ rộng để đặt kính hiển vi

- Sổ hoặc máy tính ghi lại thông tin của từng Người bệnh, đặc điểm tổn thương, kết quả chẩn đoán.

- Các sọt rác đựng rác thải y tế, rác thải thường.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Lấy bệnh phẩm:

+ Việc lấy mẫu được thực hiện bởi các khoa lâm sàng và gửi bệnh phẩm về phòng xét nghiệm Giải phẫu bệnh.

+ Phiến đồ được cố định trong cổn tuyệt đối hoặc cồn - ete: 30 giây

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 60 phút.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

Phiến đồ được cố định trong cồn tuyệt đối hoặc cồn - ete: 30 giây

Nhuộm dung dịch 1: 20 giây

Nhuộm dung dịch 2: 20 giây

Rửa nước cất: 10 giây

Cồn etanol 95°: 10 giây

Cồn tuyệt đối: 15 giây

Xylen: 15 - 20 giây

Gắn lá kính bằng bôm Canada

- Kết quả:

+ Hồng cầu: màu hồng/vàng đỏ.

+ Tiểu cầu: màu tím/hạt màu tím.

+ Bạch cầu đa nhân trung tính: nhân màu xanh, bào tương màu hồng tím.

+ Bạch cầu ái toan: nhân màu xanh, bào tương màu xanh, các hạt màu đỏ.

+ Bạch cầu ưa kiềm: nhân màu tím hoặc xanh đen.

+ Bạch cầu đơn nhân: nhân màu tím, bào tương xanh sáng.

+ Vi khuẩn: màu xanh.

4.2. Nhận định kết quả

Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh...

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Phiến đồ bị mất tế bào vào trong dịch cố định: cần để khô sau khi dàn 10-30 phút trước khi cố định bằng cồn.

- Bong bệnh phẩm: rửa nhẹ nhàng, nên dùng phiến kính có phủ chất chống bong

- Các tế bào dày, chồng chất: lấy lượng dịch vừa đủ, dàn đều tay

- Các tế bào bắt màu quá kém: cần cố định tốt và nhuộm đủ thời gian, thuốc nhuộm tốt

- Nhuộm quá đậm: tẩy bớt thuốc nhuộm bằng cồn tuyệt đối.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

2. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

59. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MÔ BỆNH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GIEMSA

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn cách thực hiện xét nghiệm và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm giemsa.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Các vi khuẩn bắt màu tím đỏ ở khe tuyến, vùng chất nhầy trên bề mặt biểu mô phủ dạ dày và các mô khác.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý.

2.2. Vật tư, hóa chất:

Các vật tư, hóa chất để thực hiện chuyển bệnh phẩm, nhuộm màu: Cồn, Giemsa, nước cất, lam kính, phiến kính, keo gắn phiến kính, bể nhuộm, giá đựng tiêu bản...

2.3. Trang thiết bị:

- Máy chuyển bệnh phẩm tự động.

- Máy đúc khối parafin.

- Bàn hơ tiêu bản.

- Máy cắt lát mỏng (microtome).

- Lưỡi dao cắt lát mỏng.

- Tủ ấm 37° và 56°.

- Tủ lạnh.

- Điều hòa nhiệt độ.

- Tủ hốt phòng thí nghiệm.

- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.

- Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Cố định

Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể được đưa ngay vào dung dịch cố định (Formol đệm trung tính 10%, Formol 10%, Bouin..) với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định khuyến cáo nhiều gấp 20-30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 4 -24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.

- Sau khi cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:

+ Chuyển bệnh phẩm

+ Vùi Paraffin

+ Đúc khối Paraffin

+ Cắt mảnh và dán mảnh

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 45 phút.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

+ Nhuộm tiêu bản

- Tiến hành kỹ thuật

+ Khi dùng, lấy Giemsa mẹ pha loãng với nước cất, tỷ lệ Giemsa/nước cất là 1/4. Lưu ý là độ pH nên bằng 7,2 – 7,6 và được điều chỉnh bằng đệm photphat.

+ Mảnh cắt được tẩy nến như thường lệ (qua xylen, cồn).

+ Rửa nước

+ Nhuộm tiêu bản trong dung dịch Giemsa đã pha loãng trong 1 giờ.

+ Rửa nước

+ Biệt hóa trong acid acetic loãng (1 giọt acid acetic với 100ml nước cất)

+ Rửa nước

+ Loại phẩm thừa bằng cồn 95°

+ Loại nước bằng xylen

+ Gắn lá kính bằng bôm Canada

+ Kết quả: Các vi khuẩn bắt màu tím đỏ.

4.2. Nhận định kết quả

Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh...

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Các mảnh cắt quá dầy, không có phần niêm mạc sẽ không phát hiện được HP.

- Dung dịch dán mảnh cắt bị nhiễm khuẩn: sẽ ngộ nhận các vi khuẩn khác với HP, trường hợp này cần thay dung dịch dán mảnh cắt.

- Thời gian nhuộm lâu hoặc nồng độ Giemsa cao đều làm cho mô bắt màu mạnh, chuyển màu xanh đen, khó nhận định kết quả, xử lý bằng cách làm nhạt màu qua cồn.

- Nước dùng để rửa có nhiều cặn bẩn gây cặn bẩn trên tiêu bản, khó đánh giá kết quả, cần sử dụng nguồn nước sạch và sử dụng lõi lọc nếu cần.

- Thuốc nhuộm cũng có thể bị cặn và nhiễm vi khuẩn làm ảnh hưởng đến việc đánh giá kết quả, nên thay thuốc nhuộm mới.

- Dung dịch Giemsa pha loãng chỉ pha trước khi nhuộm.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

2. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

60. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MÔ BỆNH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GOMORI

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn quy trình, cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Gomori.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Dựa vào tính ưa bạc của sợi võng, người ta đã sử dụng phương pháp nhuộm tẩm/ngấm bạc để phát hiện loại sợi đặc biệt này. Hai phương pháp nhuộm sợi võng thông dụng nhất là Gomori và Gordon – Sweet. Bước đầu tiên của quy trình là thực hiện oxy hóa chất đường hexose có trong sợi võng để tạo ra aldehit. Bước tiếp theo làm “tăng độ nhạy” do lắng đọng thành phần kim loại (ammonium sunfat) quanh sợi võng. Hiện tượng tẩm/ngấm bạc xảy ra khi dung dịch bạc diamin hoặc bạc ammoniac bị oxy hóa tạo ra aldehit. Oxy hóa tiếp theo của bạc diamin khi mảnh cắt được chuyển vào trong formaldehit. Bước này được gọi là “tráng bạc”. Sau cùng, kim loại vàng có trong clorua vàng đã thay thế kim loại bạc để làm tăng độ “sắc nét” sợi võng, làm chúng chuyển từ màu nâu sang màu đen.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý.

2.2. Vật tư, hóa chất:

- Dung dịch tẩy nến

- Dung dịch dầu khoáng

- Dung dịch rửa

- Bộ kít nhuộm gomori

- Bể nhuộm, giá đựng tiêu bản, lam kính, phiến kính, keo gắn phiến kính…

2.3. Trang thiết bị:

- Máy cắt lát mỏng

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Phiến kính , keo gắn phiến kính

- KHV quang học

- Máy nhuộm đặc biệt

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Cố định

Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể được đưa ngay vào dung dịch cố định (formol đệm trung tính 10%, formol 10%, Bouin…) với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định khuyến cáo nhiều gấp 20-30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 4 -24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.

- Sau khi cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:

+ Chuyển bệnh phẩm

+ Vùi Paraffin

+ Đúc khối Paraffin

+ Cắt mảnh và dán mảnh

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 90 phút.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

- Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

- Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

4.2. Nhận định kết quả

Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh...

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Nên dùng bình thót cổ đựng dung dịch bạc và khuấy kỹ mỗi khi thêm một giọt amoniac, vì nếu thêm quá nhiều amoniac sẽ làm cho dung dịch bạc kém tác dụng. Dung dịch bạc có thể pha hàng ngày trước sử dụng, nếu cần thiết.

- Dung dịch bạc amoniac có thể cất trữ ở 4°C trong vài tuần. Dung dịch này có thể nổ, nếu để tiếp xúc tực tiếp với ánh sáng mặt trời.

- Thời gian xử lý bằng dung dịch bạc – amoniac rất khác nhau phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường và hiệu lực của dung dịch bạc.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

2. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

61. XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN MÔ BỆNH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM RETICULINE

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn quy trình, cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm Reticuline.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Dựa vào tính ưa bạc của sợi võng, người ta đã sử dụng phương pháp nhuộm tẩm/ngấm bạc để phát hiện loại sợi đặc biệt này. Hiện tượng tẩm/ngấm bạc xảy ra khi dung dịch bạc diamin hoặc bạc ammoniac bị oxy hóa tạo ra aldehit. Oxy hóa tiếp theo của bạc diamin khi mảnh cắt được chuyển vào trong formaldehit. Bước này được gọi là “tráng bạc”. Sau cùng, kim loại vàng có trong clorua vàng đã thay thế kim loại bạc để làm tăng độ “sắc nét” sợi võng, làm chúng chuyển từ màu nâu sang màu đen.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý.

2.2. Vật tư:

- Dung dịch tẩy nến

- Dung dịch dầu khoáng

- Dung dịch rửa

- Bộ kít nhuộm Reticuline

- Bể nhuộm, giá đựng tiêu bản, lam kính, phiến kính, keo gắn phiến kính…

2.3. Trang thiết bị:

- Máy cắt lát mỏng

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Phiến kính , keo gắn phiến kính

- KHV quang học

- Máy nhuộm đặc biệt

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Cố định

Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể được đưa ngay vào dung dịch cố định (formol đệm trung tính 10%, formol 105, Bouin…) với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định khuyến cáo nhiều gấp 20-30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.

- Sau khi cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:

+ Chuyển bệnh phẩm

+ Vùi Paraffin

+ Đúc khối Paraffin

+ Cắt mảnh và dán mảnh

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 90 phút.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-3 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm

- Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

- Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

4.2. Nhận định kết quả

Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh...

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Nên dùng bình thót cổ đựng dung dịch bạc và khuấy kỹ mỗi khi thêm một giọt amoniac, vì nếu thêm quá nhiều amoniac sẽ làm cho dung dịch bạc kém tác dụng. Dung dịch bạc có thể pha hàng ngày trước sử dụng, nếu cần thiết.

- Dung dịch bạc amoniac có thể cất trữ ở 4°C trong vài tuần. Dung dịch này có thể nổ, nếu để tiếp xúc tực tiếp với ánh sáng mặt trời.

- Thời gian xử lý bằng dung dịch bạc – amoniac rất khác nhau phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường và hiệu lực của dung dịch bạc.

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

2. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

62. NHUỘM ZIEHL – NEELSEN TÌM VI KHUẨN LAO TRONG TỔ CHỨC

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Mô tả, hướng dẫn quy trình, cách thực hiện và chẩn đoán mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm ziehl - neelsen.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Dựa vào đặc tính kháng cồn, kháng toan của vi khuẩn có trong tổ chức để tiến hành nhuộm màu và quan sát dưới kính hiển vi quang học

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện:

- Bác sĩ: 01

- Kỹ thuật y: 01

- Hộ lý.

2.2. Vật tư:

- Dung dịch cố định bệnh phẩm

- Cồn (70°, 80°, 95°, 100°).

- Xylen hay toluen.

- Nước cất 2 lần.

- Dung dịch fucshin 0,3%

- Dung dịch Phenol

- Dung dịch HCL 3%

- Cồn ethylic 95°

- Dung dịch methylen 0,3%

- Bể nhuộm bằng thủy tinh.

- Bể thủy tinh đựng cồn, xylen

- Lưỡi dao cắt lát mỏng

- Giá đựng tiêu bản

- Dung dịch tẩy nến

- Dung dịch dầu khoáng

- Dung dịch rửa

- Bộ kít nhuộm Ziehl Neelsen (khi nhuộm tự động)

- Bể nhuộm, giá đựng tiêu bản, lam kính, lamen, keo gắn lamen…

- Găng tay, kính phòng hộ, khẩu trang...

2.3. Trang thiết bị:

- Máy cắt lát mỏng

- Tủ ấm

- Tủ hút

- Máy đo độ pH điện tử

- Kính hiển vi quang học

- Hệ thống chụp ảnh gắn với kính hiển vi

- Máy nhuộm đặc biệt

- Tủ lưu tiêu bản

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

- Cố định

Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể được đưa ngay vào dung dịch cố định (formol đệm trung tính 10%, formol 10%, Bouin…) với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định khuyến cáo nhiều gấp 20-30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.

- Sau khi cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:

+ Chuyển bệnh phẩm

+ Vùi parafin

+ Đúc khối parafin

+ Cắt mảnh và dán mảnh

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Kiểm tra phiếu chỉ định xét nghiệm: ghi đầy đủ thông tin theo quy đinh: họ tên người bệnh, tuổi, giường bệnh, tên khoa phòng, chẩn đoán, loại mẫu bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu bệnh phẩm...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật : 90 phút.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật : Phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh.

3. AN TOÀN

Thực hiện đúng tiêu chuẩn an toàn phòng xét nghiệm

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

4.1.1. Quy trình nhuộm thủ công

- Cắt và dán mảnh

+ Cắt mảnh với độ dày 2-4µm. Lấy các lát cắt đạt tiêu chuẩn (mỏng đều, không rách, không xước, không nhăn và lấy hết mặt bệnh phẩm).

+ Dùng que tãi, đưa nhẹ nhàng các lát cắt vào phiến kính (có mã số của bệnh phẩm) đã nhúng qua albumin, đặt lên bàn hơ hoặc thả các lát cắt vào khay nước ấm, để mảnh cắt dãn đều rồi vớt mảnh cắt, đặt lên phiến kính đã được tráng Albumin.

+ Dựng tiêu bản trên giá đựng tiêu bản.

+ Đưa tiêu bản vào tủ ấm 37°C.

- Nhuộm tiêu bản

+ Cố định bệnh phẩm 30 phút ở 70 °C

+ Ngâm vào 3 bể xylen, mỗi bể 5 phút

+ Ngâm vào 3 bể cồn ( 80°, 90°, 96° ) mỗi bể 5 phút

+ Rửa nước 5 phút

+ Nhỏ dung dịch Fuchsin phủ kín bệnh phẩm

+ Hơ nóng cho bốc hơi 3 lần ( không được sôi ), để nguội

+ Rửa nước

+ Tẩy màu bằng dung dịch cồn acid cho đến khi phai hết màu đỏ

+ Rửa nước

+ Nhỏ dung dịch xanh methylene phủ kín bệnh phẩm trong 1 phút

+ Rửa nước

+ Khử nước bằng cồn rồi qua xylen và gắn lamen

4.1.2. Quy trình nhuộm tự động

- Tiêu bản sau khi được cắt ở độ dày 2-4 micromet sẽ được cố định trong tủ ấm và tiến hành quy trình nhuộm.

- Chuẩn bị các bình hóa chất cho máy và bộ kit nhuộm

- Tiêu bản được mã hóa và dán barcode để máy có thể nhận biết được

- Cho tiêu bản vào buồng nhuộm và thực hiện quy trình nhuộm tự động

4.2. Nhận định kết quả

Tiêu bản sau khi nhuộm màu xong sẽ được đọc dưới kính hiển vi quang học bởi Bác sĩ, từ đó đưa ra định hướng và chẩn đoán cho người bệnh...

4.3. Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ

Trả kết quả và lưu trữ hồ sơ theo quy định của cơ sở.

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Chú ý hạn sử dụng hóa chất

- Thường xuyên kiểm tra hệ thống rửa của máy

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm và đánh giá kết quả nội kiểm theo quy định.

- Tham gia, thực hiện và đánh giá kết quả ngoại kiểm/so sánh liên phòng (nếu có).

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Specimen collection & Transport guide. 2018-2019 – Quest Diagnostic.

2. Pratical Guide to Specimen Handling in Surgical Pathology Version 9.0 - 2020 – College of American Pathologists.

63. CHUẨN BỊ MẪU MÔ VÀ ĐỌC TỔN THƯƠNG TRÊN KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ QUÉT

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Chuẩn bị mô y sinh học và vi sinh vật để soi trên kính hiển vi điện tử quét, quan sát cấu trúc siêu vi thể bề mặt mẫu.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Kỹ thuật này dùng để quan sát bề mặt mẫu kích thước cỡ nanomet dùng trong chẩn đoán, nghiên cứu và soi đặc điểm hình dạng cấu trúc bên ngoài mô.

Nguyên lý của phương pháp là các mô sẽ được cố định, làm khô, mạ phủ bằng kim loại nặng để chùm điện tử electron có thể quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện thông qua ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật.

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

- Bác sĩ Giải phẫu bệnh: 02

- Kỹ thuật viên: 02

2.2. Vật tư, phương tiện, hoá chất

- Chai, lọ thủy tinh có nắp đựng hóa chất và mẫu (Số lượng lọ phụ thuộc vào số lượng mẫu)

- Dung dịch khử khoáng (đối với các mẫu mô xương, răng)

- Dung dịch glutaraldehyde

- Dung dịch đệm cacodylat

- Dung dịch axit Osmic

- Bộ dụng cụ tiểu phẫu (Gồm dao, kéo, nỉa, kẹp có mấu và không mấu)

- Effpendof 0,5ml

- Cồn 96° (để pha các nồng độ khác nhau)

- Cồn tuyệt đối

- Nước cất

- Giấy lọc

- Băng dính cacbon

- Kính phòng hộ: 03 chiếc

- Acetone

- T-Butyl

- Isoamyl acetate

- Ống hút nhựa

- Xilanh 5ml

- Găng tay, khẩu trang, kính bảo vệ mắt và quần áo bảo hộ: 03 bộ.

- Dung dịch khử trùng (Cồn 96°) dùnglàm sạch dụng cụ,

- Kim loại mạ phủ: Vàng, Platinum, Palladium hoặc Chromium...

2.3. Trang thiết bị

- Hệ thống kính hiển vi điện tử quét,

- Máy mạ phủ

- Máy bốc bay hơi

- Máy làm khô mẫu ở điểm tới hạn

- Máy kiểm tra độ pH dung dịch

- Tủ lạnh, hộp cách nhiệt chứa đá khô hoặc đá lạnh để lưu giữ và vận chuyển mẫu bệnh phẩm.

- Điều hòa nhiệt độ.

- Tủ hút phòng thí nghiệm.

- Kính soi nổi

- Cân vi lượng.

- Vòi nước chảy, các dụng cụ

- Chai thủy tinh có nắp để đựng bệnh phẩm đã pha còn dư lại để đem hủy.

- Bình có chứa dung dịch cố định để lưu bệnh phẩm xét nghiệm thêm.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Với mẫu mô y sinh học tươi